담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

Summary

이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.

Abstract

Biofilm 형성 박테리아 가혹한 환경 조건 또는 스트레스의 시간에에서 발생 하는 동적, 다단계 프로세스입니다. 장 병원 체에 대 한 상당한 스트레스 응답 위장 운송 중 고 노출 되 면 담 즙, 인간의 소화의 정상적인 구성 요소 유도 된다. 담 즙의 살 균 효과 극복 하기 위해 많은 장 병원 체는 소장을 통해 환승 하는 때 생존을 허용 하도록 가상 biofilm을 형성 합니다. 여기 우리가 고체 상 준수 분석으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 매트릭스 감지 및 시각화를 통해 biofilm 형성을 정의 하는 방법론을 제시. 또한, biofilm 분산 평가 감염 과정에서 박테리아의 릴리스를 실행 하는 이벤트의 분석을 모방 하기 위해 제공 됩니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 높은 처리량 96 잘 접시 준수 분석 결과에서 부착 박테리아를 검출 하는 데 사용 됩니다. EPS 생산 평가 즉 두 분석 실험에 의해 결정 됩니다 현미경 EPS 매트릭스와 붙일 활용 된 다 당 류 바인딩 lectin과 반 정량 분석의 얼룩. 마지막으로, biofilm 분산 식민지 및 도금을 통해 측정 된다. 여러 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 특성화를 지원 하 고 다른 세균성 긴장에 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 식별 하기 위해 이용 될 수 있다.

Introduction

Biofilm 형성은 가혹한 환경 조건 동안 유도 하는 중요 한 세균 생존 전략 이다. 살 균 화합물에 노출 항생제 또는 영양소의 변화 또는 biofilm 형성을 통해 완화 될 수 있다 박테리아에 스트레스 상태를 유도 하는 산소 가용성. biofilm 표면 또는 다른 박테리아에 세균성 부착 특징은 고 류^1,2,3의 주로 구성 된 EPS 매트릭스의 분 비를 동반 된다. Biofilm 형성 있는 이벤트의 성숙한 부착 세균성 지역 사회^1,2,3의 형성에서 절정 동적 과정 이다. 박테리아 생성 adhesins adhesin 유전자 식 프로필 강화 biofilm 성숙 하는 동안 첨부 파일을 이동 하는 동안 초기 연결을 촉진 하기 위하여. 동시에, EPS 생산 코트 초기 스트레스 로부터 세포를 보호 하기 위해 행렬에서 세균성 지역 사회에 발생 합니다. 박테리아는 biofilm에 포함 된는 느린 성장; 따라서, 대부분의 항생제 효과 렌더링. 또한, 느린 성장 조건 세균성 성장^1,2,3를 바꿀 때까지 에너지를 절약 합니다. 가혹한 조건, 통과 후 박테리아는 biofilm를 분산 하 고 planktonic 라이프 스타일^1,2,3을 다시 시작. 전통적으로, biofilms 표면에 관찰 하 고 감염 저수지 카 테 터 및 주거에 장치^1,2,3에 따른 지속적인 임상 도전 대표.

Biofilm 형성 했다 최근 몇 장 병원 체;에 대 한 설명 작은 창 자 또는 결 장⁴감염 박테리아. Shigella 종의, 에 대 한 감염 위장의 대부분을 통해 환승 후 인간의 콜론에서 발생합니다. Shigella 담 즙;에 노출 되는 동안 작은 창 자 샛길, 동시에 대부분 박테리아⁵를 죽이 동안 지질 소화 촉진을 소장으로 분 비 지질 저하 세제. 장 병원 체 담 즙⁶의 살 균 효과 저항 하는 독특한 능력을가지고. 비보에우리의 최근 분석 활용-포도 당 및 S. flexneri 에서 강력한 biofilm 형성을 설명 하기 위해 담 즙 염의 조합 뿐만 아니라 이질균, 병원 성 대장균및 의 다른 종 처럼 살 모 넬 라⁴. 이전, 살 모 넬 라 enterica serovar 이다 만성 감염^7,,89, 중 담 낭의 독특한 식민지 인 담 즙 유도 biofilm를 표시 했다 ¹⁰. 브리¹¹및 Campylobacter¹² 사전 연구 biofilm 형성 담 즙에 대 한 응답에서을 설명 하는 또한. 따라서, 분석 담 즙 유도 biofilm 형성 관찰 다른 병원 체를 확장 하 고 담 즙을 보존된 장 병원 체 응답의 데모를 설치 하는 데 도움이. 달리 만성 biofilms는 세균 유전자 전사 제한 되며 세포 노화^1,2,3발생할 수 있습니다, 우리는 장의 담 즙 유도 biofilm 더 자연에 과도 제안 합니다. 이 과도 악성 biofilm (로 분산 분석 결과에 본) 급속 한 분해에 의해 hallmarked 고 독성 유전자 발현 biofilm 인구^4,6에서 관찰. 

Biofilm 형성은 다각적인 동적 프로세스와 담 즙 염의 사용 시작 요소가 최근 가장 장 병원 체에 대 한 설명 되었습니다만, 도구와 기술을 사용 하는 전통적인 방법의 독특하고 창의적인 응용 프로그램. 따라서, 여기에 제시 된 담 즙 소금 유도 biofilm 형성, 세균 부착, EPS 매트릭스의 생산 및 실행 가능한 박테리아의 분산은 biofilm에서를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 특성을 계량 3 무료 전략 있습니다. 이 기술은 주로 이질균;와 연구에 대 한 이용 되었습니다. 그리고 따라서 다른 장 병원 체의 평가 최적화 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 모든 3 개의 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 식별을 지원 하 고 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 위한 재현 가능한 프로토콜 설정.

Protocol

1입니다. 시 약의 준비

1. 담 즙 염 매체: 준비 하려면 tryptic 간장 국물 (TSB) 0.4% 담 즙 염 (무게/볼륨)를 포함, 50 mL에 담 즙 염의 200 mg resuspend 압력가 TSB. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 매주 신선한 매체를 확인 합니다.
   참고: 정기적으로 사용 하는 담 즙 염 나트륨 cholate와 나트륨 deoxycholate 양 및 소 gallbladders에서 고립의 1:1 혼합물 이다. 같이 이전⁴, 포도의 존재 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 위해 필요 했다. TSB은 Luria Bertani (파운드) 국물; 상대적으로 포도 당을 추가 했습니다. 따라서, 이질균 및 다른 장 병원 체 분석에 biofilm 형성을 유발 하기에 충분 했다. 분석할 박테리아에 따라 다른 포도 당 농도 또는 다른 설탕 요구 사항이 필요할 수 있습니다.
2. 0.5 물에 %w / v 크리스탈 바이올렛: 2.5 g 크리스탈 바이올렛 500ml 소 주 물에의 해산. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독.
3. Fluorescein isothiocyanate (FITC)에 활용 된 Concanavalin A (ConA): 1 x PBS에 재고를 다시 구성 하기. 25 µ g/mL의 최종 농도에 1 x PBS의 400 μ와 10 mg 집중 재고 희석 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
4. PBS + 포도 당: 10 mL 1 x PBS (마지막 2 %w / v 포도) 포도 당 0.2 g을 분해. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.
5. PBS + 담 즙 소금: 10 mL 1 x PBS에서 40 mg을 분해 (0.4 %w / v 담 즙 염 최종). 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.
6. PBS + 포도 당 및 담 즙 소금: 40 mg 담 즙 염과 10 mL 1 x PBS (0.4 %w / v 담 즙 염과 포도 당 2 %w / v 최종) 포도 당 0.2 g을 분해. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.
7. 파운드 한 천 배지를 준비 합니다.
8. 포름알데히드/글 수정: 추가 810 µ L 포름알데히드 (37% 재고 솔루션, 최종 농도 3%)와 14 mL 1 x PBS 125 µ L도 (25% 재고 솔루션, 0.25% 최종 농도). 철저 하 게 혼합 하 고 4 ° c.에 저장 수정 프로그램은 적절 한 사용에 대 한 감기 이어야 한다.
   주의: 수정 유독 하 고 유해 폐기물 처리를 요구 한다.
9. Antifade mountant 솔루션: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩을 포함 하는 antifade mountant 솔루션을 사용 하 여 붙일 박테리아의 DNA를 착 색 하는 동안 immunofluorescent 현미경 샘플의 photobleaching를 억제.

2입니다. 박테리아의 준비

1. 메 마른 문화 관에서 단일, 잘 고립 된 식민지와 TSB의 3 mL를 접종 하 여 테스트할 세균성 긴장의 숙박 문화를 성장. 야간 보육 (16-24 h)에 대 한 225 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
   참고: 긴장 해야 될 restreaked 냉장고 주식에서 매 2 4 주, 그리고 유지에 접시를 더 2 주 이상.

3. 고체 상 준수 분석 결과

참고:이 분석 결과 96 잘 접시 메서드를 사용 하 여 부착 박테리아 단정. 박테리아는 편평한 바닥 접시에서 정적으로 성장 된다. 세탁 비 점착 박테리아를 제거 하 수행 되 고 부착 박테리아 크리스탈 바이올렛으로 얼룩이 있습니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 박테리아 세포 벽에 peptidoglycan 한다 에탄올을 사용 하 여 solubilized 될 수 있습니다. 부착 박테리아의 수는 크리스탈 바이올렛 보존에 따라 결정 됩니다.

1. 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + 담 즙 염 (BS)와 레이블을 지정 합니다.
2. 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
3. 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).
4. 살 균, 분명, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 3 제어 웰 스 (TSB와 TSB + 학사) 테스트를 각 미디어 유형에 대 한 설정.
5. 3 웰 스로 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.
6. 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.
7. 플레이트 리더를 사용 하 여 세₆₀₀기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 제어 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험. 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화 하 세₆₀₀ 값을 사용할 수 있습니다.
8. 배양 접시를 부드럽게 기울이기 및 우물의 아래쪽 가장자리에 매체를 천천히 발음 하 여 진공 라인을 사용 하 여 제거 합니다. 플라스틱 표면에 부착 세균성 인구를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 해야 합니다. 경우 EPS 매트릭스 인큐베이션 기간 동안 제작 되었다, 매트릭스 흰색 침전으로 구상 될 것입니다. EPS 매트릭스를 방해 하지 마십시오.
9. 부드럽게 세척 한 번 200 µ L 살 균 PBS와 우물. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
10. 접시 건조를 반전. 건조 20 분의 최소를 허용 합니다.
    참고: 때문에 biofilm 얼룩이 지기 전에 철저 하 게 건조 해야 합니다, 프로토콜 수 있습니다 몇 시간 동안이 단계에서 일시 중지 된 또는 심지어 하룻밤. 추가 건조 시간 동안 결과 재현성의 정량화에 영향을 미칠 것입니다 불완전 한 건조 얼룩 절차를 변경 되지 않습니다.
11. 150 µ L의 0.5% 크리스탈 바이올렛 각 실험 하 고 제어를 잘 추가 합니다.
12. 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어.
13. 400 µ L의 증류수와 한 번 웰 스 워시. 추가 볼륨 우물의 측면에서 잔여 크리스탈 바이올렛 얼룩을 제거 하는 데 도움이 됩니다. 진공 라인 세척을 제거 합니다.
14. 5 번 증류수 200 µ L로 웰 스 워시. 진공 라인 세척을 제거 합니다.
    참고: 철저 한 세척이 정량화에 대 한 중요 합니다. 때 빈 우물에 증류수에서 어떤 잔여 크리스탈 바이올렛 얼룩을 포함 하지 않습니다, 다음 단계로 진행 합니다.
15. 빛 으로부터 보호 건조, 접시에 반전. 위에 언급 된 대로 접시의 완전 한 건조 있는지 확인 합니다.
16. 95% 에탄올의 200 µ L로 웰 스 destain 30 분 동안 통에 접시를 품 어. 특히 높은 온도에서 증발을 피하기 위해 4 ° c.에이 단계를 수행
17. 플레이트 리더를 사용 하 여, OD₅₄₀기록 합니다.
    참고: 크리스탈 바이올렛의 최대 흡 광도 파장은 590 근처 nm. 문학에서 OD₅₄₀ -OD₅₉₅^{4,13,14,,1516} 크리스탈 바이올렛 흡 광도;에 대 한 범위를 보고 따라서 파장 사용 가능한 플레이트 리더에 따라 선택 합니다.

4. EPS 매트릭스 검색

참고:이 무료 분석 계량 하 고 EPS를 시각화. 모두에서 EPS 류 바인딩하는 lectin를 사용 하 여 검색 됩니다. 붙일 활용 된 단백질에는 정량화 (4.1 단계) 또는 시각화 (4.2 단계) 수 있습니다.

1. EPS의 반 정량적 검출
   1. 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.
   2. 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
   3. 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분 희석).
   4. 살 균, 블랙, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 테스트할 각 매체 형식에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다. 웰 스, 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.
   5. 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.
   6. 피 펫, 이상적으로 멀티 채널 피 펫과 명확한 96 잘 접시에 문화 매체를 전송. 부착 인구 및 플라스틱 표면에 있는 EPS를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 하도록 주의 해야 합니다. 따로 설정 합니다.
   7. 1 x PBS에 포름알데히드/글의 200 µ L/우물을 사용 하 여 실시간에 15 분 동안 검은 접시를 수정.
   8. 부착 인구를 수정 하는 동안 단계 4.1.6에서에서 표면에 뜨는 부분을 평가 합니다. 플레이트 리더를 사용 하 여 세₆₀₀기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 제어 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험.
      1. 또는, 전체 분석 결과 검은 분명 바닥판에서 수행할 수 있습니다. 그 상황에서 OD₆₀₀ 값은 기록 될 수 하 고 문화 중간 이후에 4.1.7 단계로 진행 하기 전에 삭제 될 수 있습니다. OD₆₀₀ 값 정규화 데이터를 사용할 수 있는 경우에 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있다.
   9. 수정 프로그램을 제거 하 고 유해 폐기물 처분.
   10. 부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 부드럽게 접시를 기울이기 및 우물의 아래쪽 가장자리에 워시를 천천히 발음 하 여 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
   11. 150 µ L/25 µ g/ml ConA FITC, 잘 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
   12. 부드럽게 PBS의 200 µ L 두 번 씻어.
   13. 각 우물에 PBS의 150 µ L를 추가 합니다. 488에서 형광 기록 nm.
2. EPS 생산 및 biofilm 두께의 계산의 confocal 현미경 시각화
   1. 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.
   2. 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
   3. 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).
   4. 라운드 유리 coverslips 살 균 멸 균 24-잘 접시 12 m m를 설정 합니다. 3 웰 스 빈 컨트롤 역할을 uninoculated 제어 미디어의 400 µ L/잘 추가 합니다. 테스트할 각 매체 형식에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다.
   5. 중복, 웰 스에 접종 문화의 400 µ L을 추가 하 고 모든 실험 조건 도금 될 때까지 반복.
   6. 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.
   7. 시각적으로 TSB 조건, 성장 및 EPS 침전 (흰색)는 TSB에 + 학사 조건, 성장 그리고 어떠한 성장/살 균 제어 우물에 흰 침전 또는 확인 합니다. supernatants 제거 합니다.
   8. 1 x PBS에 포름알데히드/도 솔루션의 200 µ L/잘을 사용 하 여 실시간에 15 분에 대 한 수정.
   9. 수정 프로그램을 제거 하 고 유해 폐기물 처분.
   10. 부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
   11. 150 µ L/25 µ g/mL ConA FITC의 잘 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
   12. 부드럽게 PBS의 200 µ L/잘 두 번 씻어.
   13. DAPI antifade mountant 솔루션을 탑재 합니다.
       참고: 솔루션 DAPI 하면서 동시에 counterstain으로 시각화를 위한 세균성 세포에서 DNA를 얼룩이 지기 형광 라벨을 보존 하기를 위한 포함 된 기성 품, 글리세롤 기반 마운트 솔루션이입니다. 이미징 샘플 전에 부 화 시간에 대 한 키트의 지침 및 권장 사항을 따릅니다. 절차를 얼룩 DAPI DAPI를 포함 하지 않는 antifade mountant 솔루션을 적용 하기 전에 수행할 수 있습니다.
   14. Confocal 현미경 검사 법으로 평가 합니다. Confocal 현미경에 레이저 495 nm/519 nm 여기/방출 FITC 시각화에 대 한 설정. 두 번째 레이저 360 nm/460 nm 여기/방출 DAPI 시각화를 설정 합니다. DAPI 채널에 초점을 맞춤 으로써는 biofilm를 찾습니다. DAPI와 FITC 채널을 사용 하 여 전체 두께 결정 하 고 상단을 설정 하 고 낮은 테두리를 이미징. 기록 전체 두께 Z 스택 이미지 이미지를 포착 하 여 모든 0.25 µ m z-스택의 위아래에 경계를 설정 후. 에 대 한 자세한 내용은 confocal 현미경 검사 법를 참조 하십시오 게시에 의해 목장 외. ^{17 , 18 , 19 , 20}
   15. ImageJ 전체 biofilm 형성을 시각화 하 고 계산 하는 biofilm 두께 (https://imagej.nih.gov/ij/)에서 3D 이미지를 재구성 합니다. S. flexneri 담 즙 소금 유도 biofilms 취득 평균 두께 14 µ m⁴이었다.

5. 분산 분석 결과

참고:이 분석 결과에서 세균 분산 통해 biofilm의 분해는 감지 됩니다. 여기, 성숙한 biofilms는 설립 하 고 이후 (보통 다음날), 미디어 PBS로 대체 또는 보완 PBS. 표면에 뜨는 구성 요소는 다음에 biofilm에서 해리는 박테리아의 수를 quantitate에 평가 됩니다.

1. 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.
2. 각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.
3. 튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).
4. 살 균, 분명, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 테스트할 각 미디어 유형에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다.
5. 3 웰 스, 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.
6. 37 ° C에서 4-24 h에 대 한 접시를 정적으로 품 어.
7. 계속 하기 전에 따뜻한 PBS, PBS + 포도 당, PBS + 담 즙 염, 그리고 PBS + 담 즙 염 + 포도 당 37 ° c 이 시 약의 신선한 매일을 준비 합니다.
8. 플레이트 리더를 사용 하 여 세₆₀₀기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 하는 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험. 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화 하 세₆₀₀ 값을 사용할 수 있습니다.
9. 진공 라인을 사용 하 여 문화 매체를 제거 합니다. 플라스틱 표면에 부착 인구를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 해야 합니다.
10. 부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.
11. 3 우물에 다음의 130 µ L/잘 씻어 바꿉니다: PBS, PBS 포도 당, PBS 담 즙 염, 그리고 PBS + 담 즙 염 + + 포도 당. 이 시 약 37 ° c에 미리 데워 되어야 합니다.
12. 37 ° c.에 30 분 동안 접시를 품 어
13. 37 ° C 배양 기에서 접시를 조심 스럽게 제거. 신선 하 고 살 균 96 잘 접시는 supernatants 전송.
14. 10 배 준비 96 잘 접시 또는 희석 블록을 사용 하 여 (1:10) 살 균 PBS에는 상쾌한의 직렬 희석.
    참고: 희석 시리즈 undiluted에서 테스트할 세균성 긴장에 따라 10^-6 다양 해야 합니다. 파일럿 실험 최적의 희석 범위를 결정 하기 위해 수행할 수 있습니다.
15. 플레이트 5 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 파운드 agar에 각 희석의 자리. 37 ° C에서 밤새 품 어. 복구 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 결정할 때 다음 날, 희석 비율에 대 한 계정에 식민지를 계산. X (100% 설정) PBS 제어 1 기준으로 백분율 분산을 계산 하려면 각 치료 조건에서 1 x PBS 컨트롤 샘플에서 CFU 복구에 의해 복구 CFU 나눕니다.
    참고: 루틴 미디어 판 관심의 세균성 긴장에 대 한 사용할 수도 있습니다. 예를 들어 Shigella 콩고 레드 플레이트에 도금 될 수 있습니다. 플레이트는 적절 한 자리-도금 기술에 대 한 건조를 확인 하십시오.

Results

그림 1, biofilm 형성 성장의 대부분 6 장 병원 체 테스트 된 다음 담 즙 염을 포함 하는 미디어에서에서 유도 된다. 담 즙 염 노출은 거의 모든 긴장에서 관찰 후 부착 박테리아에 상당한 증가 테스트 합니다. 예외는 enteroaggregative 대장균 (EAEC); 그러나 , Δ⁴aaf 돌연변이 유발된 관찰 주의. 결과 표시 추가 부착 메커니즘 aggregative 준수 fimbriae의 부재에서 EAEC에서 담 즙 염 노출에 의해 유도 된다 난 (AAF / 난)²¹. 이 데이터 집합에서 결론, 각 스트레인 및 미디어 유형에 대 한 OD₅₄₀ 값 플롯 테스트. 미디어 컨트롤에서 각 스트레인 값 비교 (-학사) 미디어 상대적인 경우 담 즙 염 크게 bio...

Discussion

Biofilm 형성 분석 biofilms 그리고 긴장, 재료, 실험실, 및 분석 실험 사이 가변성의 동적 특성으로 인해 도전 이다. 여기 몇 가지 전략 biofilm 형성 재현성을 홍보를 제공 하는 실험적인 통찰력으로 담 즙 염 노출 다음 장 병원 체에서를 확인 하 되 게 됩니다. 재현성을 보장 하기 위해 추가 고려 사항이 있습니다. 맨먼저, 각각 관찰과 발생할 수 있는 변이 때문에 통계적 의미를 확인 하려면 기술 triplicates 실험의 적어도 3 개의 독립적인 수행 하는 것이 좋습니다. 둘째, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 사용 분석 결과의 재현성을 지키기에 생명 이다. 그것은 매우 biofilm 형성에 대 한 돌연변이 평가할 때 긍정적인 제어로 강포한 유형 긴장을 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한, biofilm 형성에 중요 한 유전자 식별 됩니다 (예를 들어 참조²² 비 브리 오, 살 모 넬 라⁷, 그...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic 간장 국물	Sigma-Aldrich	22092-500G
크리스탈 바이올렛	시그마	C6158-50
Concanavalin-A FITC	시그마	C7642-10mg
포도당	시그마	G7021-1KG
담즙염	시그마	B8756-100G
LB 한천	시그마	L7533-1KG
14mL 배양 튜브, 17 x 100mm, 플라스틱, 멸균	Fisher	14-959-11B
Vector Laboratories	사용한 Vectashield 하드 세트 안티페이	H-1500
포름알데히드	Sigma-Aldrich	F1635-500
글루테알데히드	Sigma-Aldrich	G6257
바닥이 평평한 96웰 플레이트(투명)	TPP	92696
바닥이 평평한 96웰 플레이트(검은색)	Greiner Bio-One	655076
바닥이 평평한 24웰 플레이트(투명)	TPP	92424
유리 커버슬립 12mm, 원형	Fisher	08-774-383
96웰 플레이트 리더	Spectramax
형광 플레이트 리더	Biotek Synergy 2
공초점 또는 형광등 현미경	Nikon A1 컨포칼 현미경
37° C 쉐이킹 인큐베이터	뉴 브런즈윅 과학 엑셀라 E25
37° C 플레이트 인큐베이터	Thermolyne 시리즈 5000