F₁의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

F 타입 ATP synthases는 막 도약 ATP 형성 박테리아와 미토 콘 드리 아, 엽록체의 에너지 시험 막 걸쳐 multiprotein 단지 그 몇 양성자 전 좌를 회전. ATP 합성의 회전 메커니즘의 분자 세부 정화 박테리아와 미토 콘 드리 아 ATP synthases 및 그들의 subcomplexes¹의 구조 연구 때문에 주로 알려져 있습니다. F 형 ATP synthase 막 내장 고 막 외부 moieties로 구성 됩니다. F₁막 외부 부분-ATPase, 포함 ATP 또는 역방향 반응은 아데노신 diphosphate (ADP)의 인 산화 발생 3 촉매 사이트. F₁-ATPase 공개 될 수 있는 실험적으로 막 내장 moiety에서은, 하지만 하지, ATP를 합성 하는 기능을 유지 하면서. F_o, 라고 막 도약 분야 중재 단백질 전 좌, 효소의 중앙 부분의 회전 드라이브. F₁ 과 F_o 분야 중앙과 주변 줄기로 연결 된다.

첫 번째는 F₁을 정화 하려고-1960 년대에 다시 싹 트는 효 모 및 소 심장 미토 콘 드리 아에서 ATPase. 이러한 프로토콜 사용 추출 쥡니다, 암모늄 또는 protamine 황산 염 강 수, 옵션 크로마토그래피 단계 및 열 처리^{2,3,4로 분류 한에 의해 중단 되었다 미토 콘 드리 아 ,,56}. 정화는 크게 개선 하 고 클로 프롬, F₁를 쉽게 해제 사용 하 여 단순화-미토 콘 드 리아 멤브레인에서 ATPase 조각⁷. 클로 프롬 추출 했다 다음 F₁을 추출 하는 데 사용 됩니다-ATPases 다양 한 동물, 식물 및 세균성 원본 (예를 들어, 쥐 간⁸, 옥수수⁹, 식물 maculatum¹⁰및 병원 성 대장균 ¹¹). 더 클로 프롬 발표 F₁의 정화-ATPase 선호도 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 굴복 했다 엑스레이 결정학에 의해 고해상도 구조 결정을 위해 적당 한, 매우 순수한 단백질 복잡 한로 F₁의 구조에 의해 문서화-소 심장^12,13 를 Saccharomyces cerevisiae¹⁴ATPase. F₁-ATPase 구조 또한 육성 하기 어려운 유기 체에서 결정 하 고, 따라서, 초기 생물 학적 물질의 양을 제한 했다. 이 경우에는 F₁에서-ATPase subunits 인위적으로 표현 되었고, 대장균에 복잡 한에 조립 및 전체 분리 효소 태그 소 단위 친화성 크로마토그래피 를 통해 에 의해 순화 되었다. 이러한 접근 방식은 F₁의 결정을 주도-ATPase 구조 두 thermophilic 박테리아 종, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ Caldalkalibacillus thermarum^16, 에서 ^{그러나 17}.,이 방법론은 오히려 진 핵 F₁에 적합 하지 않습니다-ATPases 이후 간결한 protheosynthetic 장치, posttranslational 처리 및 복잡 한 어셈블리에 의존.

클로 프롬 기반 추출은 이전 F₁을 분리 하는 데 사용 됩니다-ATPases 단 세포 digenetic 기생충 Trypanosoma cruzi¹⁸ 와 토니 brucei¹⁹, 미국인을 일으키는 중요 한 포유류 병원 균 및 아프리카 trypanosomiases, 각각, 그리고 monogenic 곤충 기생충 Crithidia fasciculata²⁰에서. 이 담긴 F₁의 간단한 설명만 이끌어-ATPases, 다운스트림 응용 프로그램 완전히 구성, 구조, 및 복합물의 효소 속성을 특성화 하는 데 사용 했다. 이 문서에서는 설명 합니다 F₁에 대 한 최적화 된 방법- 토니 brucei의 교양된 곤충 라이프 사이클 단계에서 ATPase 정화. 메서드는 소 및 효 모 F₁-ATPases^21,22의 격리에 대 한 설립된 프로토콜에 따라 개발 된다. 절차는 매우 순수 하 고 동종 효소 적합 체 외에서 효소 그리고 금지 분석 실험, 질량 분석²³, 및 구조 결정²⁴상세한 proteomic 특성화를 생성합니다. F₁의 지식과 정화 프로토콜-ATPase 구조 원자 수준에서 화면 작은 분자 억제제, 식별 하 고 아프리카 trypanosomiases에 대 한 새로운 약물의 개발에 도움을 설계 하는 가능성을 엽니다. 또한, 프로토콜 정화 F₁을 적용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase.

1. 버퍼 및 솔루션

1. 아래에 나열 된 솔루션을 준비 합니다. 액체 크로마토그래피에 대 한 모든 버퍼 드 그냥 사용 하기 전에 ADP, benzamidine, 및 프로 테아 제 억제제를 추가 합니다.
   1. Aminocaproic 산 (ACA), 그리고 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 염 산 (Tris HCl) ph 8.0, 0.25 M 자당 5 m m benzamidine, 5mm 버퍼 a: 50 mM Tris 버퍼를 준비 합니다.
   2. 버퍼 b: 50 mM Tris HCl pH 8.0, 0.25 M 자당, 4 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 5mm benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP, 및 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A)를 준비 합니다.
   3. Q 열 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO₄, 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 및 1mm ADP.
   4. Q 열 차입 버퍼 준비: 1 M NaCl와 Q-열 버퍼.
   5. 초 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 10mm MgSO₄, 100 m m NaCl, 1 mM ADP.
   6. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5 포화를 준비 합니다. 클로 프롬을 믹스 2 M Tris HCl ph 8.5 스크류 캡 병에 약 1:1 비율에서, 흔들, 유기와 수성 단계 분리 시키고 pH 지시자 종이 스트립 위 수성 층에서 pH를 측정. 실내 온도에 상점. 그냥 사용 하기 전에, 다시 동요 하 고 별도 단계를 보자. 낮은 클로 프롬 레이어를 사용 합니다.
      주의: 클로 프롬은 휘발성과 눈과 피부에 자극. 증기 두건에서 작동 합니다. 안전 안경 흔들어 사용 합니다.

2입니다. 하위 미토 콘 드리 아 입자의 준비

1. 침투성 세포²⁵ 에서 1 x 10¹¹ procyclic T. brucei 얼음 버퍼 A. 유지 샘플 단계 3.2까지 냉장의 5 ml의 2 x 10¹¹ 셀에 의해 고립 된 미토 콘 드리 아 소포 (mitoplasts) resuspend
2. Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과²⁶ 제조업체의 지침에 따라에 의해 정지에 단백질 농도 결정 합니다.
   1. 초순에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 희석 시리즈를 사용 하 여 표준 곡선을 건설 하기 위하여. 적은 양의 샘플 BSA의 범위는 표준에 맞게 초순 물으로 20-100 배 희석.
   2. 샘플에서 총 단백질 양을 계산 하 고 추가 버퍼 A. 그것을 diluting 하 여 16 mg/ml 단백질 농도가지고
3. 서 스 펜 션 7의 쥡니다 여 mitoplasts 거꾸로 소포 막 조각으로 조각 15 x 3.9 m m의 직경을 가진 70 ~ 100 J는 microtip와 충 동 당의 총 에너지와 s. 초음파 균질 화기는 에너지 출력을 표시 하지 않으면, 최대 전력의 50%에서 최적화를 시작 합니다. 30 대 한 얼음 샘플을 품 어 충 동 사이 s. 쥡니다, 후 정지가 된다 약간 어두운.
4. 토사는 막 ultracentrifugation 54000 x g 16 h 또는 98000 x g 5 h 4 ° c.에 의해 조각 가만히 따르다는 상쾌한 클로 프롬 추출 진행 또는 플래시 동결 액체 질소에는 토사와-80 ° c.에 그것을 저장합니다

3. F₁의 릴리스-클로 프롬에 의해 막에서 ATPase

1. 작은 Dounce 균질 화기의 도움으로 버퍼 B에에서 미토 콘 드리 아 막의 펠 릿을 resuspend. 버퍼 B의 볼륨에 따라 총 버퍼의 사용 단계 2.1과 2.2를 사용 하 여 다음 수식에서 계산: 볼륨 (버퍼 B) = 볼륨 (버퍼 A) x 12/21. 15 또는 50 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송.
2. 얼음에서 샘플을 제거 하 고, 지금부터, 샘플 및 실 온에서 사용 될 모든 솔루션을 유지.
3. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5; 포화를 추가합니다 클로 프롬을 추가할 수의 현 탁 액의 절반 볼륨을 같습니다. 단단히 뚜껑을 닫습니다. 흔들어 적극적으로 정확히 20 s. 8400 x g 실 온에서 5 분에서 그것을 즉시 원심.
4. 1.6 mL microtubes 이동 상단 흐린 수성 단계. 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 클로 프롬 치료에 의해 제거 억제제를 대체를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 13000 x g 에서 샘플 원심 신선한 microtubes는 상쾌한 전송 하 고 모든 불용 성 재료를 제거 하는 원심 분리를 반복 합니다.

4. 음이온 교환 크로마토그래피

1. Equilibrate 280에서 흡 광도까지 5 mL/min의 유량에 Q 열 버퍼와 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착 된 5 mL 음이온 교환 (Q) 열 전도도 및 안정화 (버퍼의 약 50 mL).
2. 280에서 흡수도 될 때까지 대기를 1 mL/분의 유량에 equilibrated 열에 3.3 단계에서는 상쾌한 로드 nm 안정화는 배경에서. 0.5 mL/분 수집 1 mL 분수의 흐름 속도에서 100 %0 %에서 Q-열 차입 버퍼의 25 mL 선형 그라데이션이 적용 됩니다.
3. PH 8.0에 풀 먼 ATPase 분석 결과² ATP 가수분해 활동에 대 한 주요 차입 피크에 해당 하는 개별 분수 시험 반응 혼합물의 1 mL 당 각 분수의 10 µ L을 사용 합니다. ATPase 활동 하는 분수를 풀. 선택적으로, 나트륨 라우릴 인산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)에 각 분수의 10 µ L 고 Coomassie 파란 개별 F₁을 시각화 하 여 젤 얼룩-ATPase 소 단위 및 오염 단백질.
4. 막 한 200-500 µ L. 100000 MWCO PES 필터 스핀 열을 사용 하 여 풀링된 샘플 초 또는 게 실 온에서 하룻밤 샘플 진행 하는 집중.

5. 크기 배제 크로마토그래피

1. SEC 열 0.5 mL/min의 유량에 SEC 버퍼의 적어도 48 mL (2 개의 열 볼륨)와 액체 크로마토그래피 시스템에 연결 된 equilibrate
2. 열에 샘플을 적용 하 고 수집 0.25-mL 분수 0.25 mL/분의 유량에서 크로마토그래피를 실행 합니다.
3. SDS 페이지에 UV_280nm 흡수도 추적의 봉우리에 해당 하 고 Coomassie 블루 얼룩 분수의 10 µ L를 실행 합니다. F₁을 포함 하는 첫 번째 주요 피크-ATPase. 풀 먼 ATPase 분석 결과 의해 ATP 가수분해 활동 및 아 지 드 감도 대 한이 피크에 해당 하는 분수 시험 BCA 분석 결과 의해 단백질 농도 결정 합니다.
4. 순화 된 F₁유지-실내 온도에 ATPase 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정화 후 3 일 이내 사용 하 고. 또는 100000 MWCO PES 필터 > 1.5 mg/ml, 촉진 그것 포화 황산 암모늄을 혼합 하 여 pH 8.0 (볼륨 x 1.2), 조정 회전 열을 사용 하 여 샘플을 집중 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다

일반적인 정화 (그림 1) T. brucei 셀25 표준에서 양식 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll 그라데이션에 고립 된 미토 콘 드 리아 소포 (mitoplasts)로 시작 포도 당-풍부한 SDM-79 중27. mitoplasts 쥡니다, 돌 다에 의해 조각화 되 고 포함 하는 매트릭스 상쾌한 삭제 됩니다. 미토 콘 드리 아 막 클로 프롬 F1을 출시와 함께 처리 됩니다-ATPase. 원심, 후 유기 단계 및 침전 된 interphase는 삭제 됩니다. 수성 단계는 분류 한 4 급 암모늄, 강한 음이온 교환기 (그림 2A)에 이온-교환 크로마토그래피에 의해. 주요 차입에 해당 하는 분수 피크 하 고 F1을 포함-ATPase 풀링된 및 집중. 이 자료는 잔류 불순물을 제거 하는 초에 대 한 입력으로 제공 합니다. 주요 오염 물질은 분리 된 피크, 그림 2B에서 어두운 녹색 막대로 표시로 SEC 열에서 elutes dihydrolipoyl 효소 이다. F1-첫 번째 지배, 크게 대칭 피크 (그림 2B)에 ATPase elutes.

정화의 진행 BCA 단백질 분석 결과 (또는 다른 일반적인 단백질 분석 결과), 다음은 SDS 페이지, 그리고 ATPase 활동의 감시. 분석 결과2, 결합 된 반응에서 NADH의 흡 광도의 감소에 따라 재생 풀 먼 ATP ATP 가수분해의 속도 측정 됩니다. 나트륨 아 지 드, F1의 설립된 억제제-ATPase, F1의 비율을 결정 하는 2 m m 농도에서 사용 됩니다-ATPase-특정 ATP 가수분해. 일반적으로, 입력된 자료에는 미토 콘 드 리아 vesicles의 원본으로 사용 하는 셀의 수에 따라 미토 콘 드리 아 단백질의 약 150-300 밀리 그램 포함 되어 있습니다. 아 지 드-민감한 비율 총 ATPase 활동의이 단계에서 약 30% ~ 40%입니다. 클로 프롬 적 출 후 샘플에 ATPase 활동의 90% 이상이 F1에 기여-ATPase. 순화 된 F1-ATPase는 거의 완전히 아 지 드 치료 (는 최소 잔여 ATPase 활동 배경 ATP autolysis에 기 인할 수 있다)와 약 1의 대략적인 수율 입력된 단백질 질량의 1%를 나타냅니다- F1의 1.5 m g-1 x 1011 셀 (표 1) 당 ATPase. 순화 된 F1의 분리 후 전형적인 밴드 패턴-SDS 페이지 젤 Coomassie 파란 얼룩 뒤에 ATPase 그림 2C에 표시 됩니다. 단백질은 펩 티 드 질량 지문 및 다양 한 질량 분석 접근23자세히 특징에 의해 확인 되었다. Β 소 단위 밴드 위에 보이는 산발적 약한 밴드 α3β3 투구 (이합체 및 올리고의 α-및 β-소 단위)의 subcomplexes를 대표 하 고 어떤 오염 물질의 중요 한 질량 분석 기술에 의하여 발견할 수 없다. 순화 된 F1-ATPase 저장할 수 있습니다 실 온에서 초 버퍼에 몇 일. 또는, F1-ATPase ≥2 mg/ml 농도 ph 8.0으로 조정 하 고 4 ° c.에 저장 된 초 버퍼에서 포화 황산 암모늄의 동일한 볼륨에 의해 침전 수 강 수 후 6 개월 이상, 어떤 소 단위의 분명 한 저하 없이 활성 효소 redissolving 초 버퍼 또는 유사한 솔루션에 침전 된 물질에 의해 얻어질 수 있다. 그러나, 한 달 이상 저장이 아니다 적합 결정 화, 실험적으로 결정.

그림 1 : 정화 절차의 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 클로 프롬 발표 F1의 2 단계 정화-액체 크로마토그래피에 의해 ATPase. (A) 음이온 교환 크로마토그래피 (위 패널)와 선택 된 분수의 차입 프로필 Coomassie 파란 염료 (하단 패널)로 얼룩진 10%-20% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤에서 분리. 추적 블루: 280에서 UV 흡 광도 nm; 붉은 추적: 차입 버퍼;에 NaCl의 농도 입력: F1-클로 프롬; 발표 ATPase FT: 흐름-통해. (B) 초 (위 패널)와 선택 된 분수의 차입 프로필 Coomassie 파란 염료 (하단 패널)로 얼룩진 SDS 페이지 젤에서 분리. 입력: 풀링된 F1을 포함 하는 음이온 교환 크로마토그래피에서 분수-ATPase. 패널 A 와 B 에서 색상된 막대 SDS-PAGE로 분석 된 차입 프로필에 분수와 각각 젤에 해당 레인을 표시 합니다. 격리 된 F1의 개별 단백질의 (C) 정체성-ATPase 질량 분석에 의해 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 전형적인 진보와 F1의 항복의 예-1 x 1011 procyclic T. brucei 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 ATPase 정화.

저자는 공개 없다.