전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

모든 시 냅 스 처럼 NMJ 3 요소의 구성: 터미널 연 접 신경 postsynaptic 신경/이펙터 셀에서에서 파생 하 고 perisynaptic glial 세포^1,2. 시 냅 시스 전송의 기본적인 측면 처음이 시 냅 스³에서 설명 되었다, 하는 동안이 프로세스의 여러 측면,이 시 냅이 스의 고유 셀룰러 요소에 의해 동일한 분자의 표현 때문에 부분에서 알 수 없는 남아 있습니다. 예를 들어 모터 뉴런 척추 NMJ에 의해 공동 출시 되는 퓨 린 아데닌 뉴클레오티드 ATP와 아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 근육, Schwann 세포, 모터 신경, 따라서 복잡의 해석에 의해 표현 됩니다. 이러한 물질 (예를 들어, 송신기 릴리스 또는 응답, 근육 힘 세대)⁴에 의해 발휘 하는 기능 효과. 또한,는 NMJ의 같은 구성 요소는 간단한에 비해, 예를 들어 신경 중앙 신경 조직에 여러 개의 시 냅 스 입력, 수시로 전시 하는 모터 신경 세포, 근육 세포, 또는 Schwann 세포 다를 기반으로 하는 자극에 대 한 응답 여부 그들의 내장에 (예를 들어, 배아 파생, 섬유 하위, 형태학)이 명확 하지 않다. 각 이러한 문제를 해결 하기 위해 그것은 동시에 같은 시간, 같은 다른 별도 요소 중 하나에 응답에 트랙 뿐만 아니라 한 시 냅 스 요소 내의 많은 세포의 응답을 추적 하는 것입니다. 칼슘 신호 측정 화학 염료를 사용 하 여 기존의 전략 목욕 적용 염료 조직으로, 신청 후 여러 셀 유형에 의해 채택 되 고 침 로드 염료 시각화에 사용할 수 있기 때문에이 두 가지 목표를 달성할 수 없는 셀의 개인 또는 작은 동료 여기, 휴대 전용 칼슘 신호, 특정 영상 및 소프트웨어 도구⁵, 우리는이 두 가지 전반적인 목표의 처음을 설명 하 고 토론을 측정 하도록 설계 GECIs를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 이용 하 여 어떻게의 새로운 유전자 변형 도구 두 번째 달성 도움이 될. 이 기술은 추적 칼슘 역학 또는 동시에 여러 세포 인구에서 유전자 인코딩 광학 센서를 통해 이벤트 관찰할 신호 다른 세포에 관심이 사람에 대 한 유용할 것 이다.

축산 및 실험 치료 및 실험 동물의 사용 및 네바다의 대학에 IACUC 국가 학회 건강 가이드에 따라 수행 했다.

1. 격 막 및 유전자 변형 쥐에서 인할지 신경의 준비

1. 유전자 변형 쥐와 유전자 형을 oligonucleotide 뇌관 이러한 마우스 구입.
   참고: 뇌관은 이러한 쥐의 각에 대 한 "정보" 페이지에 표시 됩니다.
   1. Cre 드라이버 대립 유전자 변형/노크-에서 적절 한 1 부와 조건부 GCaMP3의 하나 또는 두 개의 복사본을 표현 하는 같은 나이의 두 번째 마우스 조건부 GCaMP3/6 대립 유전자의 복사본 0 3-6 개월 마우스 사육 / 6 대립 유전자와 제로 사본의 Cre 드라이버 대립 유전자.
   2. 유전자 형 Cre와 조건부 GCaMP3/6 대립 새끼와 마크 것 들-이 이제부터 이중 유전자 변형 쥐 이라고 불릴 것 이다 (예를 들어, Myf5 Cre, 조건부 GCaMP3)⁶.
      참고:이 방법으로 모든 데이터는에서 파생 Cre와 조건부 GCaMP3/6 대립 유전자의 복사본 하나를 표현 하는 쥐. 이 십자가에 다른 돌연변이 마우스 (예를 들면, 녹아웃)에 추가할 때 이것은 특히 중요 하다입니다.
2. 적절 한 나이의 이중 유전자 변형 쥐가 되는 때 (예를 들어, 0 또는 5 [P0 또는 P5] 출생 후 하루 또는 성인)가 위 (P10 보다 젊은 쥐)에 대 한 그들을 목이 또는 isoflurane 흡입 챔버에 배치 하 여 쥐를 안락사-때 더 이상 꼬리를 꼬 집는 집게의 쌍을 가진 반응, 그들은 희생에 대 한 준비입니다.
3. 가 위로 잘린 여 동물을 희생.
4. 전체 동물 간 바로 아래와 심장 그리고 iridectomy가 위 폐 바로 위에 걸쳐 transversely 섹션.
5. 멀리 간, 심장, 그리고 충분히 흡입 전극 (즉, 1-2 cm)으로 얻을 수 긴 인할지 신경의 길이 유지 하기 위해 주의 되 고 폐 해 부.
   참고: 왼쪽된 인할지 신경 왼쪽된 횡 경 막의 중간 부분을 입력 하는 직물의 백색 조각으로 확인할 수 있습니다. 그것은 폐를 제거할 때 잘라 하지 해야 합니다. 바로 인할지 신경도 뛰어난 베 나 정 맥을 포함 하 고 얇고 하얀 베 나 정 맥 보다는 근 막의 조각 내에서 실행 됩니다. 함께, 그들은 둘 다 오른쪽 중간 격 막 관통.
6. 또한 흉 곽과 횡 경 막 주위의 얇은 릿지를 제외한 척추 열을 제거 합니다.
7. 어둠 속에서 10 분 1 µ g/mL 594-αBTX와 Krebs 벨 솔루션 microfuge 관에서 횡 경 막과 인할지 신경 샘플을 놓습니다.
   참고: 594-αBTX의이 농도 그들의 기능 (개인 관찰)를 차단 하지 않고 ACh 수용 체 (AChRs) 라벨.

2. 자극과 근육 활동 전위의 기록

1. 횡 경 막을 무력화 minutien 핀을 사용 하 여 고정 6 cm 접시에 실리콘 유 전체 젤 코팅 산소 Krebs 벨 솔루션의 ~ 8 mL 가득 하 고 현미경 스테이지에 배치. 30 분에 대 한 더 많은 Krebs 벨 솔루션 (8 mL/min) 격 막 perfuse
   참고:이 빨고 언바운드 594-αBTX로 조직 해 부 후에 equilibrates.
2. ⁷설립된 방법 따라 흡입 전극을 확인 합니다.
   1. Micromanipulator를 사용 하 여 4 배 확대에서 왼쪽된 인할지 신경 흡입 전극 이동 하 고 흡입 전극에 연결 된 배관에 연결 된 5 mL 주사기의 배럴을 밖으로 당겨 흡입을 적용 합니다.
      참고: 성공적으로 흡입 전극으로 당겨 때 인할지 신경 긴장 된입니다. 자극을 자극은 인할지는 수동 틀 지 하 여 신경 스위치 1 x.
   2. 횡 경 막 계약 1 Hz 자극에 응답에서 시각적으로 명시 조명 그것을 검사 하 여 확인 합니다. 그렇지 않은 경우에 점차적으로 근육 수축의 시각적인 검사에 의해 확인 될 수 있는 supramaximal 펄스를 달성 하기 위해 전압 조절기를 켜는 여 전압을 조정. 아직도 보이지 않는, 주사기와 신경 려 고 흡입을 적용 하 여 다시 그리는 시도.
3. 관류를 끄고 특정 근육 myosin 억제제 제너 시스⁶ 또는 전압 개폐 나트륨 채널 길 항 제 µ-conotoxin⁸ 100 µ M의 최종 농도를 추가.
   1. 100 µ M 제너 시스, DMSO에 200 m m 재고 4 µ L 플라스틱와 Krebs 벨 솔루션의 1 mL에 predilute.
   2. 접시에서 Krebs 벨 솔루션의 1 mL를 제거 합니다.
   3. 접시에 제너 시스 prediluted를 추가 합니다.
      참고:이 predilution GCaMP3 표현 셀에 임시가 아닌 형광 반응의 undiluted DMSO에 의해 유도 방지할 수 있습니다.
   4. 30 분을 기다려 하 고, 또 다른 20-30 분에 대 한 신선한 Krebs 벨 솔루션의 관류를 켭니다.
4. 기록 전극 준비.
   1. 입고 장갑는 1 m m와 0.4 m m의 내부 직경 (ID)의 외경 (OD)와 붕 규 산 filamented 유리 micropipette 끌어당기는 장소와 위치에 그것을 클램프로 다이얼을 조여. 끌어당기는 사람 문을 닫습니다.
   2. P-97 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음과 같은 설정 프로그램: 900에서 열, 120에서 당겨, 75에서 속도, 250, 500, 그리고 아무 추가 루프에서 압력에 시간.
      참고: Resistance (R)는 앰프의 소프트웨어 컨트롤을 사용 하 여 측정: 수식 V를 해결 하 여 저항을 확인 하는 데이터 수집 소프트웨어 적외선 = 소프트웨어 컨트롤러 전극을 통해 알려진된 전류 (I) (일반적으로 1 없음)를 전달 하 고 우리 인민에 대 한 해결 하기 위해 활성화 전압 (V)에 변화를 측정
   3. 배아 격 막에 대 한 저항 60 m ω, 및 더 오래 된 격 막, 10-20 m ω에 대 한 있는지 확인 합니다. 3m KCl와 기록 전극 로드.
5. 10 배 확대에 전극 자극 전극으로 무대의 반대 측에 두 번째 micromanipulator를 사용 하 여 근육에 낮은.
6. 휴식 막 잠재력 0에서-65로 변경 될 때까지 기다립니다 electrophysiological 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여, mV 또는 아래.
7. 1 Hz에서 자극 하 고 겸손 한 오버 슛을 전시 하는 큰 잠재력을 확인 하 여 근육 활동 전위의 존재를 확인 (0 이상으로 상승 잠재력-65에서 시작 될 때 뮤직 비디오 mV 또는 아래). 활동 전위와 자극 유물을 혼동 하지 마십시오.
   참고: 잠재력은 상당히 긴 기간 (~ 5 ms)에 자극 유물 보다.

3. 샘플의 형광 이미징

1. 20 X 확대, 녹색/황색 빛 여기에서 NMJs 594-αBTX-표시를 찾아 근육의 중심에 종판 밴드 찾습니다 (550 nm). 파란 가벼운 흥분으로 전환 (470 nm) 이미지 캘리포니아^{2 +} 근육, 모터 신경, Schwann 세포에 응답을.
2. 원하는 경우, 대역 통과 필터와 듀얼-파장 이미징 dichroic 단일에 지 필터 이미지 스플리터를 설정 합니다.
3. GCaMP3/6 표현 조직에 의해 전시 최대 형광 (Fmax)를 계산 하기 위해 횡 경 막 준비⁶3 M 염화 칼륨 (KCl)의 12 µ L를 추가 합니다.
   1. GCaMP3/6 표현 조직 KCl에 binning 없이 20 배 확대에 채도 전시 하는 레벨의 110%로 설정 하는 조회 테이블 바에 밝기 바와 실험을 수행 합니다.
4. 어떤 빠른 이벤트를 놓치지 하지 초당 20 프레임에 기록.
5. 충 동을 사용 하 여 흡입 전극의 기차를 제공 하 여 신경 자극의 20-40 Hz의 1-45 s 자극 하 고 또는 목욕 응용 프로그램 또는 관류 약리 촉진제를 추가 하 고 동적 형광 캘리포니아^{2 +} 응답 한 셀 하위에 수집 함께 정적 594-αBTX NMJ 신호.
   참고: 조직의 특정 빨강 또는 빨강 GECI 또는 GEVI 마우스는 NMJ에 사용 하기 위해 사용할 수 있게, 그들은 NMJ에 두 가지 세포 요소를 반영 하는 두 개의 동적 신호 수집을 사용할 수 있습니다.
6. 끝나면 이미징 또는 electrophysiological 실험은 원하는 결과 달성 했기 때문에, perfuse 관류 라인을 통해 물 하 고 물 2 배-3 배 소금 구축 하지 않습니다 보장 하기 위해 흡입 전극을 통해 빨 아.

4. 수출 및 (SD_iu16) 형광 강도의 표준 편차 지도 데이터의 분석

1. 16 비트 TIFF 스택으로 기록 된 이미지 시퀀스를 기록 하 고 분석을 위해 원하는 이미지 데이터 분석 시스템으로 그들을 로드.
2. 소프트웨어의 8 d 파일 메뉴에서 관심의 이미지 스택 을 선택 하 고 로드를 클릭 합니다.
   1. 비디오 로드, 일단은 아무 세포 형광 활동 섹션을 식별 하는 시간을 통해 검색 합니다.
      참고:이 지역의 배경 샘플을 만드는 데 사용 됩니다.
   2. Shift 를 누른 배경 샘플 지역으로 확인 된 지역 지역 관심 (ROI) 상자를 클릭 합니다.
   3. 상자를 만든 후 배경 활동 변경의 플롯을 생성 하기 위해 스페이스 바 를 누르십시오.
   4. 추적 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 xy 좌표 텍스트 파일로 추적을 덤프 텍스트로 ROI 에 옵션을 제시 하는 여러 옵션을 선택 합니다.
3. 다시 관심의 비디오를 이동, 다시 관심의 활동 발생 시간 영역을 식별 하기 위해 스캔.
   1. 마우스 가운데 단추를 사용 하 여 노란색 시간 상자에이 시간 영역을 선택 합니다.
   2. 동영상에 단추로 스택 본부 및 다음 합계 지도 옵션 5 선택 합니다.
      참고: 왼쪽된 창에 표준 편차 (SD 지도) 지도 생성 됩니다.
   3. SD에 클릭 하 고 다음 눌러 ] 키 19 x 적용 적절 한 색상 열 지도를.
   4. SD 지도 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 STM 로드 및 저장, SD 지도 저장 하 stm tiff로 저장 하는 옵션을 제공 합니다를 선택 합니다.
   5. 그때, 기자 [ 키 19 x는 회색조 색상 지도 돌아갑니다.
   6. C 와 다음 D 밀도 매핑 도구를 누릅니다. 왼쪽된 마우스 버튼, 가운데 마우스 버튼 사용 하, 임계값 SD 지도에 표시 된 모든 형광 활동을 조정할.
   7. C 임계값 설정을 유지 하면서 밀도 도구를 닫으려면 누릅니다.
   8. SD 지도 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택한 STM 입자 다음 찾을 PTCLS.
      참고:이 형광 활동을 표현 하는 개별 셀을 식별 합니다.
   9. SD 지도 한 번 더 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 입자 ROIs 만들기를 선택 합니다.
      참고:이 관심의 원본 동영상에서 선택한 셀을 입력 해 것입니다.
   10. Shift 키를,하는 동안 원본 비디오에 지금은 확인 된 입자 ROIs 중 하나에 마우스 오른쪽 단추로.
   11. 투자 수익 마커 및 투자 수익의 측정 Int를 선택 합니다.
       참고:이 관심의 비디오에서 확인 된 각 투자 수익에 대 한 개별 형광 활동 플롯을 생성 합니다. 이 텍스트로 덤프 ROI선행 Assorted, 선택 하 고 아무 이들 중 하나를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 저장 될 수 있습니다.
4. 이러한 작업을 기본 자세한 논리, 소스 코드 파일⁹를 참조 하십시오.

형광 강도 변화, 세포내 캘리포니아2 + , NMJ의 정의 된 세포 유형 내에서 증가 의해 중재의 몇 가지 예는이 접근의 유틸리티 표시. 이러한 결과 응답 셀의 위치 뿐만 아니라 셀 수 응답 및 얼마나 많은 각 셀에 특정 응답의 평가 되므로 그들의 반응의 강도 제공 하는 공간 형광 강도 지도 제시 자극입니다. 예를 들어 그림 1에서 보듯이, 우리의 동영상을 했습니다 터미널/perisynaptic Schwann의 인구에서 캘리포니아2 + 응답 P7 Wnt1-Cre;의 격 막의 NMJs에 셀 (TPSCs) 조건부 GCaMP3-인할지 신경의 자극에 대 한 응답에서 마우스 하 고 공간 형광 강도 지도 응답 셀의 모집단 식별 표현. 형광 강도의 이러한 지도 열 지도 하 고 불 색 조회 테이블 (화재 CLUT)에 따라 색상으로 구분 되 게 됩니다. 우리는이 영화와 동시에 횡 경 막 (비디오 1 과 2), 중간 α BTX 표시 된 AChRs의 클러스터를 볼 이미지를 분할 하지 않고 기록 동적 GECI 또는 GEVI 캡처 쉽게 적용할 수 있는 방법을 두 가지 응답은 겹치지 여기 및 방출 스펙트럼을 전시 하는 그들의 각각 종류, 세포.

그림 2, 우리는 P4 Myf5 Cre; 조건부 GCaMP3의격 막에 동일한 신경 자극 실험을 수행-마우스와 근육 세포에 Ca2 + 응답을 이미지로 표현. 흥미롭게도, 우리가 사용 myosin 차단기 제너 시스 또는 골격 근육 특정 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav1.4) 차단기 µ-conotoxin (그림 2A 와 비디오 3 또는 그림 2B 비디오 4, 각각) 우리는 캘리포니아2 + 과도 하 근육 섬유의 전체 길이 여행 sarcoplasmic 그물 또는 단순히 종판 밴드의 길이에서 작업 잠재적인 캘리포니아2 + 의 출시에 의해 중재를 나타내는, 나타내는 시각화는 종판 잠재력과 AChR.In 뿐만 아니라 공간 형광 강도 응답 셀의 모집단을 식별 통해 extracellular 캘리포니아2 + 유입에 의해 중재 지도 (SD 지도), 그림 1과 같이, 우리는 또한 변화를 측정 형광 spatiotemporal (세인트)으로이 근육 세포의 인구에 동안에 매핑합니다. 이러한 실험의 각각 다른 세포 유형, 다른 시대, 다른 치료 (신경 자극 대 신경 자극 다른 약물의 존재)와 (공간 대 spatiotemporal 분석의 종류를 나타냅니다. 형광 강도 지도). 이 수치 또한 유전자 변형 GCaMP 표현 쥐, 즉 반복적으로 자극 하 고 동일한 샘플 이미지 및, 따라서, 다른 치료의 효과 테스트 하는 능력의 가장 유용한 기능 중 하나를 보여 줍니다.

그림 1: 측정 활동 유도 Schwann 세포 캘리포니아2 + 에 반응의 막과 P7 Wnt1-Cre;의 인할지 신경 조건부 GCaMP3 쥐. (A) (왼쪽) 평균 형광 강도 이미지, Schwann 세포 인할지 신경 분 지를 따라와 (NMJ), 신경 근육 학 교차로에서 형광의 배경 수준을 보여주는 신경 자극 (Prestim) 전에 체포 됐다. 이 배경 형광의 값은 신경 자극 후 가져온 형광 값에서 뺍니다. (오른쪽) 캘리포니아2 + 응답 30 후 생성의 16-비트 형광 강도 단위 (SDiu16)의 표준 편차의 공간 지도 인할지 신경 자극 (Stim 지도 또는 SD 지도)의 40 Hz의 s 터미널/perisynaptic Schwann에에서 강력한 응답을 보여줍니다 NMJ에 셀 (TPSCs)입니다. 화재 CLUT heatmap SDiu16 이며 눈금 막대 미크론에서 이다. E B -패널에서 모든 이미지는 패널 A에서 같은 확대. (B) (왼쪽) 같은 격 막 594 활용 된 α-bungarotoxin (α-BTX)을 하 고 아 세 틸 콜린 수용 체 (AChRs), 라벨은 NMJ를 식별 하기 위해 녹색/황색 빛과 흥분으로 분류 됐다. (오른쪽) 이 패널 표시 같은 격 막의 관찰법 이미지는 NMJ에 유도 될 수 있습니다, 세포내 기록 전극 (화살표)의 끝을 보여주는 α-BTX 라벨 기반으로 합니다. (C) Ca2 + 과도 기능 (예:강도, 자극, 후 발병 기간) 개별 셀 또는 셀 그룹의 입자 (왼쪽)로 공간 강도 지도에서 개별 영역을 정해 여 평가할 수 있습니다 그들이 시간이 지남에 그들의 농도 플로팅 관심사 (ROIs), 및 (D)의 색된으로 지역 대표. (E)이이 패널 보여줍니다 듀얼-파장 GCaMP3 중재 형광 캘리포니아2 + 응답 및 594-α 라는 NMJs의 신경 자극 후 쌍둥이 이미지 분배기를 사용 하 여 동일한 격 막에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

비디오 1: 이미지 Schwann 세포 활동 유도 Ca의 분할 수 없이 영화 2 + 응답 P7에 자세히 설명 된 대로에 그림 1 전설. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

비디오 2: 영화 이미지 분할 활동 유도 Schwann 세포 Ca 2 + 응답 및 594- P7에 자세히 설명 된 대로에서 α BTX 표시 된 AChRs는 그림 1 전설. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

그림 2: 셀 근육 활동 유도 캘리포니아2 + P4 Myf5 Cre;의 격 막에 반응의 측정 조건부 GCaMP3 쥐. (A) (왼쪽된) Nicotinic AChR 횡 경 막의 중앙에 위치한 종판 밴드의 클러스터 594-α-BTX 표시 됩니다. (중간) 30 후 생성 된 Ca2 + 과도 농도 (SD 지도)의 공간 지도 myosin 억제제 제너 시스, 존재 인할지 신경 자극의 40 Hz의 s 모든 격 막 근육 세포의 전체 지역에 걸쳐 응답을 보여줍니다. (오른쪽) 반면, 나v1.4 적 µ-conotoxin를 (µ-CTX), 존재 하지만 동일한 자극 후 동일한 격 막에서 생성 된 SD 지도 전시 공간 제한 모든 격 막 근육의 중간 영역에 응답 하는 세포 AChR 클러스터 농축 종판 밴드에 해당합니다. 화재 CLUT heatmap SDiu16 이며 눈금 막대 미크론에서 이다. (B)이이 패널에서는 spatiotemporal 지도 캘리포니아2 + 과도 농도 (세인트 지도) 동안 근육 세포의 인구 (y-축) 시간이 지남에 따라 (x-축). 눈금 막대 초에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

비디오 3: 근육 활동 유도 세포 Ca의 영화 2 + 응답 P4에 자세히 설명 된 대로에 myosin 차단기 제너 시스의 존재는 그림 2A 전설. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

비디오 4: 근육 활동 유도 세포 Ca의 영화 2 + 나의 응답 v 1.4 적 µ-conotoxin P4에 자세히 설명 된 대로에 그림 2B 전설. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

저자는 공개 없다.