Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

염증 성 프로세스를 통해 생성 된 산소 대사 산물 세포 구성 요소¹의 파괴적인 변경 뿐만 아니라 다양 한 신호 폭포에 기여 한다. 선생님을 측정에 과민 하 고 특정 기술을 활용 하는 것이 염증 성 프로세스를 공부 및 산화 스트레스의 효과 대 한 중요 합니다. Vivo에서 화상 진 찰은 조직 생활에에서 동적 공간 및 시간 데이터를 제공 하는 기능 때문에 중요 합니다. L-012는 superoxide 음이온에 대 한 매우 민감한 이며 생산 하는 세포, 조직, 및 전 혈^1,2,3, 에서 다른 형광 프로브 보다 높은 빛의 강도 합성 chemiluminescent 조사 ⁴. 그것은 성공적으로 고용 되었다 vivo에서 화상 진 찰 murine 모델에 대 한 여러 염증 성 질환, 관절염, colitis^5,6을 포함 하 여 공부 하. 그것은 아직 설립된 피부 상처 치유 모델에에서 채택 한다. 생성 된 선생님의 측정은 동등 하 게 다른 조건 하에서 상처 치유의 진행 평가 관련이 있다. 이 방법의 비 침 투 적인 자연과 감도 네요 murine 모델에 걸쳐 상처 치유를 공부 하는 유망 기술.

Nrf2 항 산화 반응과 transcriptional 요소 여러 항 산화 효소⁸의 발기인 지구에 공통 항 산화 반응 요소 (는)에 대 한 특이성의 주요 드라이버입니다. 산화 스트레스의 부재, Nrf2는 세포질에 연속적으로 그것의 ubiquitination 및 저하를 일으키는 원인이 되는 Keap1에 의해 격리 됩니다. Nrf2/Keap1 통로의 불균형 부적절 한 산화 환 원 항상성 및 산화 스트레스를 증가⁹의 설정에서 지연된 상처 치유에 연루 되었습니다. 우리가 나타났습니다 이전 Keap1의 Nrf2 활동 증가 자극 하 고 촉진 당뇨병 pathologic 피부 상처 치유의 구조⁹상처.

여기는 L 012를 이용한 생물 발광 excisional 피부 상처 치유 모델 선생님과 상처 치유 사이 협회를 강조를 위해 중요 하다는 선생님 수준을 측정에 이미징 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 기술은 산화 부담 상처와 즉각적인 주변 내에서 실시간으로 변화를 보여 줍니다. 또한,이 방법은 신속한 개입 및 메커니즘의 평가 대 한 그 영향을 산화 환 원 처리 수 있습니다. 여기 사용 Keap1 최저 모델 산화 환 원 항상성의 복원에 대 한 우리의 전략의 적용 가능성을 평가 합니다. 우리의 기술은 비 침략 적 이며 상처를 방해 하지 않습니다, 때문에 같은 동물 조직학 또는 세포 lysates 기초 더 확실 한 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 뉴욕 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다. 모든 마우스는 장벽 뒤에 지 내게 하 고 모든 직원이 적절 한 개인 보호 장비를 착용.

1. 일 0: Excisional 상처 치유의 Murine 모델의 준비

1. 당뇨병 (Lepr^db/db) 쥐, 8-12 주, inhalational 2 %isoflurane 세 anesthetize 각 마우스는 되었습니다 제대로 취 발 패드 핀치 테스트를 사용 하 여 확인 합니다. 건조에서 자극을 방지 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 윤 활 유를 적용 됩니다. 연구원은 isoflurane를 사용 하 여 동물을 마비 하는 때 그들의 기관 수의 직원의 지침을 따라야 한다.
2. 쥐의 무게 고 각 마우스의 몸 무게를 기록 합니다. glucometer을 사용 하 여 각 동물의 혈액 포도 당을 기록 하 여 동물의 당뇨병 상태를 확인 합니다.
3. 절차 작업 영역 및 마 취 장비를 소독. 헤어 트리머를 사용 하 여 마우스의 지 느 러 미를 제거 뒤에 멀리 초과 머리를 닦아 머리 제거 로션의 응용 프로그램. 알코올 잎사귀를 사용 하 여 두 번, 노출 된 피부를 청소 하 고 건조를 허용 합니다.
4. 두 개의 10 m m 전체 두께 상처 치유 기법^7,8확고 excisional 상처에 따라 살 균 10 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 panniculus carnosus를 통해 확장을 만듭니다. 멸 균 글러브를 사용 하 여 모든 생존 수술에 대 한. 오토 클레이 브 수술과 수술 필드에만 오픈 전에 가방에 모든 수술 기구.
5. 부 목 상처는 10 m m 원형 배 기판을 가진 0.5 m m 두꺼운 실리콘 시트를 사용 하 여 열고 보안 장소를 사용 하 여 스 텐트 4-0 비단 봉합 중단.
6. 다음 수술, 마 취에서 동물을 제거 하 고 적절 한 복구를 용이 하 게 하는 패드를가 열에 놓습니다. 메모의 절차 동안, 동물 체온 감소 하는 경우 동물 이동할 수 있습니다가 열 패드를 이전 마 취 몸 열 손실을 최소화 하기 위해. 깨어 및 모바일 때까지 동물을 모니터링 합니다.
7. 일단 완 치, 개별 감 금 소, 음식 및 물 (수술 농축에 대 한 감 금 소의 바닥에는 어떤 음식을 확인)에 동물을 반환 합니다. 2 주 동안 추가 중첩 물자 났습니다 종이 타 올을 제공 합니다. 불리 한 상호 작용 및 상처 치유 상태에 변화를 방지 하기 위해 다른 동물 들과 함께 수술을 받은 동물을 집 하지 마십시오.
8. 수술 후 통증 완화를 위해 주사 마우스 피하 buprenorphine 0.1 mg/kg의 몸 무게에서 함께 하루에 두 번, 3 일에 대 한 절차에 따라 즉시 시작.

2. 주 1: Keap1 siRNA의 준비

참고: 캐비닛 biosafety 안에 모든 치료를 준비 합니다.

1. 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 37.5 µ L 12.5 µ L 20 µ M Keap1 siRNA (siKeap1)의 (250 pmol)와 결합 하 여 siRNA 희석을 준비 합니다.
2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 liposome 믹스의 25 µ L로 감소 된 혈 청 매체의 25 µ L를 결합 하 여 liposome 희석을 준비 합니다.
3. 50 µ L liposome 희석 dropwise (1:1 볼륨)에 siRNA 희석의 50 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
4. 실 온에서 20 분 동안 품 어.
5. 물에 2% 스 젤의 50 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.
6. 난센스 시NS (제어)와 함께 각 동물을 치료 또는 시Keap(실험적인) 1. 상처의 정상에 젤을 적용 합니다. 투명 필름 드레싱 유지 하 젤, 이동성을 유지 하기 위해 무료로 사지를 유지 동물의 몸통을 감싸 줍니다.

3. 주 3: L-012 솔루션의 준비

참고: 캐비닛 biosafety에 모든 시 약을 준비 합니다.

1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 0.5 mg/100 mL의 농도에서 1 X PBS에 L-012을 준비 합니다.
2. 수동으로 소용돌이 microcentrifuge 튜브입니다. 그러나 L-012 않습니다 하지 완전히 용 해는 PBS에 액체에 균등 하 게 중단 되어야 합니다. 메모의 해산 다음 주입 방해 생리 전해질 균형을 피하기 위해 물에 L-012 시도 하지 마십시오.
3. 27 G 바늘을 사용 하 여 1 mL 주사기로 솔루션을 전송 합니다.
   참고: 빛에서 L-012 솔루션을 보호 해야 합니다.

4. 주 3: Vivo에서 화상 진 찰 당뇨병 상처의

1. Inhalational 2 %isoflurane 마우스 anesthetize 연구원은 isoflurane를 사용 하 여 동물을 마비 하는 때 그들의 기관 수의 직원의 지침을 따라야 한다. 각 마우스는 되었습니다 제대로 취 발 패드 핀치 테스트를 사용 하 여 확인 합니다. 건조에서 자극을 방지 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 윤 활 유를 적용 됩니다.
2. 부드럽게 상처를 방해 하지 않고 쥐에서 투명 필름 드레싱을 제거 합니다.
3. 그들의 각각 명령에 이미징 챔버에는 마우스를 놓습니다. 챔버에 적절 한 O₂ 수준을 유지 하려면 1.0 L/분 이미징 시스템 유입 및 유도 챔버 O₂ 레벨을 설정 합니다.
4. 생물 발광와 L-012 화합물의 주입 하기 전에 기준선에서 사진에 대 한 마우스를 이미지.
5. 알코올 잎사귀와 복 부를 닦 고 건조 허용. 5 mg 200 g 몸 무게 27-게이지 바늘을 사용 하 여 당에 L-012 해결책의 복 주사를 수행 합니다. 예를 들어 마우스 무게 20 g L-012의 0.5 mg을 받아야 한다.
6. L-012 주입 직후 다시 이미징 약 실에 있는 그들의 각각 위치에에서 쥐를 놓습니다. 4 분 간격으로 1 분간 60 분 동안 쥐를 이미지. 선생님의 수준 결정에 대 한 관심의 영역으로 10 mm 상처를 정의 합니다.
7. 다음 수술, 마 취에서 동물을 제거 하 고 적절 한 복구를 용이 하 게 하는 패드를가 열에 놓습니다. 깨어 및 모바일 때까지 동물을 모니터링 합니다.
8. 일단 완 치, 1.6에서 설명한 동일한 수술 농축 환경 유지, 개별 연습장에 동물을 반환 합니다. 불리 한 상호 작용 및 상처 치유 상태에 변화를 방지 하기 위해 다른 동물 들과 함께 수술을 받은 동물을 집 하지 마십시오.

설립된 excisional 상처 모델 (그림 1A), 양자 상처를 만든 후 3 일 당뇨병 쥐 이미징 챔버에 배치 됩니다. 초기 사진 그리고 생물 발광의 측정 L-012의 주입 하기 전에 배경 신호 (그림 1B)에 대 한 계정에 찍힌다. L-012 솔루션 복 주입, 따라 쥐 챔버에 재배치 됩니다 및 생물 발광 선생님 탐지 되는 상처의 영역에서 시각화 (그림 1C). 올바른 이미징 및 분석 설정 그림 2에 설명 된 대로 선택한 후 영상 진행. 생물 발광은 60 분 (그림 3)의 과정 동안 5 분 간격으로 1 분에 대 한 기록 됩니다. 이 시간이 지남에 관심 영역의 생물 발광 채도를 보여 줍니다. 우리의 동물 모델에서 최적의 이미징 시간 완전 한 L-012 포화를 도달 하는 50 분, 후 생물 발광에 주목할 만한 차이가 평가 되었다 결정 했다. 이번이에 동물에 따라 달라 집니다 모델 활용 한다 독립적으로 결정 되 고 상처 모델 크기, 동물의 종류, 치료, 등 다양 한 최적화

당뇨병 상처 영역에 제한 된 생물 발광을 측정 목적 (투자 수익) 관심 영역에 오버레이 이미지 (그림 4) 그려집니다. 이러한 ROIs 1 siRNA 취급 생쥐 (그림 4C) 넌센스 siRNA 치료 (그림 4B)와 KeapL-012 주입 전후 L-012 주입 (그림 4A)을 포함 하는 모든 상처에 대 한 마찬가지로 정의 됩니다. 생물 발광 빛의 강도 영역별로 총 횟수 나누어 계산 됩니다. 표 1 그림 4D에 그래프로 계산을 보여준다. 넌센스 siRNA 치료 당뇨병 상처 했다 45,775 11,649 생물 발광/cm2, 19,405 5,939 생물 발광/cm2 (평균 SD) 귀착되 었 다 Keap1 억제 하는 동안. 스튜던트 t-검정 증명 현저히 감소 생물 발광 (p = 0.042)는 Keap1 siRNA 치료 상처, siRNA 치료 넌센스에 비해 상처 높은 Nrf2 활동 (그림 낮은 산화 부담으로 상호 연결에 4 D). 상처 조직 섹션 우리 분석 선생님 시NS 와 염증을 측정의 다른 설립된 방법으로 siKeap1 상관에 L-012에 의해 시각의 상대적인 수준, 10 일 확인. H & E 얼룩 보여주었다Keap1에 세포 침투를 감소-시NS달리 상처 치료-치료 그들, 나타내는 감소 염증 형태 (그림 5A). F4/80, 단백질 대 식 세포 마커 (레드 형광) 공개 상처 조직 단면도에 immunoreactivity 감소 시NS에 비해 대 식 세포 들Keap1 치료 상처-상처 (그림 5B) 취급. 이 추가 L-012에 의해 시각 선생님 수준 정확 하 고 다른 설립 선생님 측정 모델 상관 관계가 보여 줍니다. 비판적으로,이 기술을 적용 한 할 거 하지 조직 섹션 H & E와 면역 형광 염색 법에 대 한 필요에 대 한 동물을 희생.

그림 1: 이미징 실험 설정. (A) 당뇨병 쥐는 설립된 excisional 상처 모델을 사용 하 여 상처를 입었다. 생물 발광 사전-L-012 주입으로 사진 (B) 초기 오버레이. (C) L-012와 복 주입, 다음 선생님의 시각 이다. B와 C에 대 한 발광 규모 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 이미지 및 분석 설정 체 외에 이미징 시스템 프로그램에. (A) 선택 "이미징 마법사" 수집 컨트롤 패널 (빨간색 화살표). (B) "생물 발광 영상"는 영상 모드를 선택. (C) "오픈 필터" 측정 기법으로 선택 됩니다. (D) 영상 주제 선정 "마우스" 이며 "시리즈 연구 시간" 옵션을 선택. 세그먼트와 세그먼트 사이 지연 시간 총 수 입력입니다. (E) 선택 취득 "시퀀스" 영상 진행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 선생님 이미징 vivo에서 의 경도 연구. 당뇨병 쥐 5 분에서 L-012와 복 주입 다음 1 분 간격으로 60 분 레드의 과정을 통해 동아리에 대 한 이미지는: 투자 수익. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 생물 발광 측정. 당뇨병 상처 (A) L-012 주입, (B) 이전와 상처의 생물 발광 오버레이 사진 L-012 주입, 및 (C) 후 상처 치료 시Keap1 L-012 주입 후 죄와 처리. 평균 생물 발광의 (D) 정량화는 죄 및 siKeapROIs의 표면적 1 치료 상처 나누어 됩니다. 노란색 원: 투자 수익. 데이터는 mean±standard 편차;로 표시 됩니다. p < 0.05, n = 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: immunohistochemical 얼룩 상관 관계 선생님. (A) H & E 얼룩 당뇨병의 10 일 상처 조직 섹션 보였다 감소 된 세포질 침투 시Keap1 에 감소 염증 형태학의 증거 취급NS-si에 비해 상처 치료 상처. (B) f 4/80 면역 형광 (레드) 보였다 세포의 감소 번호Keap1 치료 상처에NS-그들의 시에 비해 10 일 섹션 처리 대응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: ROIs 정의 대 한 생물 발광 측정. 생물 발광은 각 투자 수익에 대 한 측정 하 고 표면 영역을 기준으로 표준화. 평균, 표준 편차, 표준 오류에 대 한 계산에 따라 계산 됩니다. 투자 수익 1, 죄의 생물 학적 반복의 2, 3, 및 4 대표 상처에서 ROI 치료 당뇨병 상처와 투자 수익 5, 6, 7, 및 8 대표 ROIs 생물학 반복에서 siKeap1 의 당뇨병 상처 치료.

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