Summary

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Published: August 28, 2019
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Summary

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Abstract

Astrozyten gehören zu den häufigsten Zelltypen im erwachsenen Gehirn, wo sie eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von Funktionen spielen. Als zentraler Akteur bei der Homöostase des Gehirns versorgen Astrozyten Neuronen mit lebenswichtigen Metaboliten und puffern extrazelluläres Wasser, Ionen und Glutamat. Astrozyten sind ein integraler Bestandteil der “Tripartiten”-Synapse und sind auch entscheidend für die Bildung, Beschnitt, Wartung und Modulation von Synapsen. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander und mit anderen Gliazellen, Neuronen, der Gehirnvaskulatur und der extrazellulären Umgebung durch eine Vielzahl von spezialisierten Membranproteinen, die Zell Adhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Spaltknotenmoleküle. Um diesen dynamischen Fluss zu unterstützen, verlassen sich Astrozyten, wie Neuronen, auf eng koordinierten und effizienten intrazellulären Transport. Im Gegensatz zu Neuronen, wo der intrazelluläre Handel umfassend abgegrenzt wurde, wurde der mikrotubulierbasierte Transport in Astrozyten weniger untersucht. Nichtsdestotrotz orchestriert der exo- und endozytische Handel mit Zellmembranproteinen und intrazellulären Organellentransporten die normale Biologie von Astrozyten, und diese Prozesse sind oft bei Krankheiten oder als Reaktion auf Verletzungen betroffen. Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll zur Kultur hochwertiger muriner Astrozyten, zur fluoreszierenden Kennzeichnung von astrozytären Proteinen und Organellen von Interesse und zur Aufzeichnung ihrer intrazellulären Transportdynamik mittels zeitrafferkonfokaler Mikroskopie. Wir zeigen auch, wie man relevante Transportparameter aus den aufgenommenen Filmen mit verfügbaren Bildanalyse-Software (d.h. ImageJ/FIJI) Plugins extrahiert und quantifiziert.

Introduction

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen im erwachsenen Zentralnervensystem, wo sie einzigartige entwicklungs- und heimostatische Funktionen ausführen1. Astrozyten modulieren synaptische Entwicklung durch direkten Kontakt mit prä- und postsynaptischen Terminals als Teil der Tripartit-Synapse, die Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Zelladhäsionsmoleküle enthält, die die Synapsenbildung erleichtern und Neuron-Astrozyten-Kommunikation2. Darüber hinaus steuern Astrozyten aktiv die synaptische Übertragung und verhindern neuronale Exzitotoxizität, indem sie exzitatorische Neurotransmitter schnell aus dem synaptischen Spalten entfernen, Neurotransmitter recyceln und an synaptischem Schnitt teilnehmen3 , 4 , 5 , 6. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander, mit anderen Gliazellen und mit Neuronen durch spezialisierte Membranproteine, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Lückenknotenmoleküle. Astrozyten verändern aktiv die Oberflächenniveaus dieser Proteine als Reaktion auf Schwankungen in ihrer intra- und extrazellulären Umgebung7. Darüber hinaus modulieren Veränderungen in den Konzentrationen und der Verteilung von Mitochondrien, Lipidtröpfchen und abbauenden und recycelnden Organellen die Energieversorgung, die Verfügbarkeit von Metaboliten und zelluläre Clearingprozesse, die für die Astrozytenfunktion und überleben.

Die dynamischen Veränderungen des Membranprotein- und Organellenhandels und der Positionierung in Astrozyten werden durch die konzertierte Funktion von motorischen Proteinen und Adaptern erleichtert, die die BeweglichkeitderLadung 8,9fördern. In ähnlicher Weise werden die Oberflächenniveaus von Membranproteinen durch Internalisierung simonieren und Recyceln10moduliert. Diese Ladungen werden über ein kompliziertes Netz von Actin, Mikrotubuliund möglicherweise Zwischenfilamenten 8 transportiert. Studien auf der Grundlage der Immunfluoreszenzfärbung des Endbindungsproteins 1 (EB1), das sich an den wachsenden Mikrotubuli plus Enden ansammelt, deuten darauf hin, dass in Astrozyten Bündel von Mikrotubuli aus dem Perinucleus ausstrahlen und ihr Plus-Ende in Richtung Peripherie11. Eine umfassende Untersuchung der Organisation und Polarität von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Elementen mittels Live-Zell-Bildgebung fehlt jedoch noch. Während viele der Mechanismen, die der Dynamik von Organellen und Membranproteinen zugrunde liegen, ausgiebig in Neuronen und anderen Zelltypen untersucht wurden, ist die Beweglichkeit der Ladung in Astrozyten weniger gut verstanden. Der größte Teil unseres derzeitigen Wissens über Veränderungen der Protein- und Organellenverteilung in Astrozyten basiert auf der traditionellen Antikörper-basierten Kennzeichnung fester Zubereitung, die eine genaue räumliche und zeitliche Untersuchung der Ladungsdynamik ausschließt7, 12.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von Membranproteinen und Organellen für live-Bildgebung in hochreinen primären Maus-Astrozytenkulturen. Anhand dieses Protokolls liefern wir Beispiele, in denen wir die dynamische Lokalisierung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP) verfolgen, die mit Membranproteinen in transfizierten Astrozyten getaggt sind, einschließlich des Spaltknotenproteins Connexin 43 (Cx43-GFP) und der exzitatorischen Aminosäure Transporter 1 (EAAT1-GFP). Wir beschreiben auch die Verwendung einer fluoreszierenden säureotropen Sonde, um saure Organellen zu visualisieren und deren Handelsdynamik in lebenden Astrozyten zu verfolgen. Abschließend zeigen wir, wie die Zeitrafferdaten analysiert werden, um Transportparameter für einzelne Ladungen zu extrahieren und auszuwerten.

Protocol

Alle tierischen Eingriffe wurden mit Genehmigung der University of North Carolina im Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Hirnsektion und Kultur der primären Mausastrozyten HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von veröffentlichten Methoden angepasst, die dem ursprünglichen Verfahren folgen, das von McCarthy und deVellis13,14,15entwickelt wur…

Representative Results

Das oben beschriebene Protokoll zur Etablierung primärer Maus-MD-Astrozyten sollte reproduzierbare, hochwertige Kulturen liefern. Obwohl Kulturen zunächst eine Mischung aus Astrozyten, Fibroblasten und anderen Gliazellen, einschließlich Mikroglia und Oligodendrozyten enthalten (Abbildung 1Bi,Biv; rote Pfeilspitzen), minimiert die Zugabe von AraC zur Mischkultur zwischen DIV5-DIV7 die Proliferation dieser Schadstoffzellen. Die kombinierte AraC-Behandlungs- und Schüttelrei…

Discussion

Hier beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, um fluoreszierend markierte Organellen und Membranproteine von Interesse mithilfe der Zeitraffer-Videomikroskopie in hochreinen primären Maus-Kortikus-Astrozyten auszudrücken, zu visualisieren und zu verfolgen. Wir skizzieren auch eine Methodik zur Messung der Partikeldynamik. Die direkte Visualisierung der Protein- und Organellendynamik in primären Astrozyten bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Transports in diesen Zellen in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DNL wurde von der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) School of Medicine als Simmons Scholar unterstützt. TWR wurde von UNC PREP Grant R25 GM089569 unterstützt. Die Arbeit mit der Kerneinrichtung des UNC Neuroscience Center Microscopy wurde teilweise durch Fördermittel des NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und des NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 unterstützt. HD079124.

Materials

2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090-046
Benchtop Centrifuge Thermo Scientific 75-203-637 Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water Gen Clone 25-511
Cell Culture Microscope Zeiss WSN-AXIOVERT A1 Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside Sigma C1768-100MG (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI Sigma D9542-5MG Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 305
Dissecting Scissors F.S.T 14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen Clone 25-500
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106 Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH Version 1.52i
Fine Tip Tweezers F.S.T 11254-20 Style #5
Fluorescence light source Excelitas 012-63000 X-Cite 120Q
GFAP antibody Cell Signaling 3670S GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes Mattek corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps F.S.T 11054-10 Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) Life Technologies L7526 LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x) Gibco 14065-056 Magnesium and calcium free
Imaging Media Life Technologies A14291DJ Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope Zeiss LSM 780
KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent Life Technologies 11514015 Plus Reagent
Lipofection Reagent Life Technologies 15338100 Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator New Brunswick Scientific 8261-30-1008 Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x) Gen Clone 25-512
Phosphate Buffered Saline (10x) Gen Clone 25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7405 Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium Gibco 31985-062 OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks Olympus Plastics 25-209 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator Thermo Scientific 51030285 HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base Sigma T1503 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl Sigma T3253 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Vacuum-Driven Filter Systems Olympus Plastics 25-227 500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight Roboz RS-5620

References

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Cite This Article
Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).

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