여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 이식, 자궁 표면 상피에 대한 정착 및 접착및 모계 데시두아에 배반증이 잇따라 침입한 것은 기술적, 윤리적 한계로 인해 역사적으로 연구하기가 어려웠던 중요하면서도 수수께끼같은 생물학적 사건이다. 이식은 초기 트로포 블라스트에 트로페토데름의 개발과 뚜렷한 열대 성세포 하위로 후속 분화에 의해 시작된다. 비정상적인 초기 트로포블라스트 분화는 이식 실패, 태반 병리, 태아 이상 및 유산으로 이어질 수 있습니다. 최근에는 인간 배아가 인체의 이식 기간을 포괄하는 시동 조직부재에서 체외에서 13일째까지 자라도록 하는 방법이 개발되었다. 이것은 연구원에게 인간 이식을 조사하고 모성의 영향을 혼동하고 생체 내초기 배아 분화 사건을 연구하기 위하여 내재된 장애물을 피하지 않고 이 중요한 기간 도중 trophoblast 분화의 역학을 재정의할 기회를 주었습니다. 이식 중 상이한 트로프토블라스트 서브라인지를 특성화하기 위해 기존의 2차원(2D) 확장 배양 방법을 채택하고 하류 분해를 위해 다양한 유형의 트로피컬블라스트 세포를 효소적으로 소화하고 분리하는 절차를 개발했습니다. 2D 조건에서 배양된 배아는 비교적 평평한 형태를 가지며 생체 내 3차원(3D) 배아 아키텍처에서 모델링에 최적이 아닐 수 있다. 그러나, trophoblast 분화는 확장된 문화의 과정을 통해 예상된 형태학 및 유전자 발현 변경에 의해 입증된 바와 같이 보다 적게 영향을 받는 것처럼 보입니다. 사이토트로토블라스트, 싱크티오트로포블라스트 및 철새 트로포블라스트를 포함한 다른 열대성 아열대는 크기, 위치 및 측두적인 출현으로 구분될 수 있으며, 추가 특성화 또는 실험에 사용될 수 있다. 이 초기 trophoblast 세포의 조사는 일반적인 태반 병리를 취급하고, 임신 손실의 부각을 완화하는 인간 이식을 이해하는 중요한 역할을 할 수 있습니다.
서론
인간의 이식과 초기 태반의 출현은 역사적으로 어렵고 임신이 임상적으로 감지 할 수없는 경우 이 단계에서 인간의 조직에 접근 할 수 없기 때문에 크게 알려지지 않았습니다. 인간 태반은 다른 유테리안 포유류에 비해 고유 한 특징을 가지고 있기 때문에 동물 모델은 부적절합니다. 예를 들어, 인간의 태반은 다른 세포가 자궁 나선형 동맥을 리모델링하는 동안 자궁 근막의 적어도 내부 3 분의 1에 도달하는 일부 영양 세포와 데시두아 깊숙이 침입한다. 심지어 우리의 가장 가까운 진화 조상, 비 인간 영장류, 모계 decidual조직1,,2,,3과태반 형태와 열대 성술 상호 작용의 차이를 보여줍니다 . 체외에서 이식 전 인간 배아를 얻는 것은 1980년대까지 는 임상 인간이 체외 수정(IVF)이불임치료를 위한 일상적인 관행으로 시작될 때까지 가능하지 않았다. 지금, 인간 blastocysts는 전송을 위한 더 실행 가능한 태아의 선택을 허용하기 위하여 시험관에서 성장될 수 있고, 뿐만 아니라 안전한 유전 시험을 가능하게 합니다. 배아 배양 기술의 개선뿐만 아니라 IVF의 사용이 증가함에 따라 환자의....
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프로토콜
모든 인간 배아는 연구에 사용하기 위한 동의하에 기증되었습니다. 확장된 인간 배아 문화에 대한 프로토콜은 서부 기관 검토 위원회 (연구 번호 1179872)에 의해 승인되었으며 국제 지침을 따릅니다. 인간 배아의 사용은 이 프로토콜을 사용하여 연구 기관과 관련된 적절한 윤리 및 관리 기관에 의해 검토되어야 합니다.
1. 준비
- 멸균 라미나르 플로우 후드에서 배아 온난화 하루 전에 미디어 및 복구 플레이트를 준비합니다.
- 10% v/v 혈청 단백질 대용(SPS)으로 2mL의 배반성 배양 배지(BM)를 준비한다.
참고: Blastocyst 배양 배지는 추가 단백질을 함유할 수도 있거나 포함하지 않을 수 있습니다. 여기서, 우리는 표시된 알부민 단백질의 10%로 보충되어야 하는 매체를 사용했습니다. 이 보충의 변화에 대 한 제조 업체 지침을 확인. 모든 미디어는 멸균 주사기에 부착된 멸균 0.22 μM 필터를 사용하여 계피하기 전에 필터링해야 합니다. - 배아 배양 등급 오일 500 μL로 덮인 10% v/v SPS로 BM 500 μL로 두 개의 센터 웰 장기 배양 세척 접시를 채웁니다.
- 60mm 조직 배양 접시에서 배아 배양 오일의 8mL을 층으로 한 다음 배양 판의 바닥에 1....
- 10% v/v 혈청 단백질 대용(SPS)으로 2mL의 배반성 배양 배지(BM)를 준비한다.
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결과
건강한 배아는 확장된 배양(도2B)의과정을 통해 지속적인 증식을 나타냈다. 비정상적인 배아는 외부 가장자리에서 후퇴하기 시작했고붕괴(그림 2C). 우리의 경험에서, 배아의 대략 75%는 48 h에서 fibronectin 코팅 된 접시의 바닥에 부착하고 배양에서 약 90 %로 증가. 배아 부착의 성공은 크게 배반구의 초기 품질에 의해 영향을받을 수있다. 72h에 의해 부착되지 않은 배아는 살아남을 가능성이 높습니다.
D8 포스트 수정(D3)에서 배아내 대부분의 세포는 영양세포 마커 GATA3(도3A)에대해 양성인 CTB였다. 세포성 축하 세포는 이미 배아의 주변에 다중 핵STB로 분화하기 시작했다(도 2B,왼쪽 패널, 점선). 이러한 STB시트와 같은 외관을 가지고 인간.......
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토론
이식을 통해 인간 배아를 배양하는 프로토콜의 개발은 과학자들이 개발8,,9에서이전에 미지의 시간을 탐구할 수 있게 해 주었다. 여기서, 우리는 인간 배아를 배양하고 villous 태반의 형성 전에 초기 trophoblast 분화를 연구하기 위하여 확장된 배양 시스템을 이용합니다. 여기에 설명된 방법은 다운스트림 단세포 분석에 사용하기 위해 다른 TB 하위계를 수집할 수 있게 해주다. 이 연구는 과학 공동체가 인간 발달에서 이 중요하고 수수께끼적인 기간을 이해할 수 있는 기회를 허용하고, 유산 또는 자간전증과 같은 그밖 태반 병리를 위한 치료 처리를 위한 새로운 기회를 열 수 있을 뿐만 아니라, 초기 인간 발달에 관하여 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확장 된 배양 전에 배아 스트레스를 최소화하기 위해 배아 온난화, 조나 제거 및 도금 중에 배아를 신속하게 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 콜로라도 생식 의학 센터 (CCRM)의 많은 환자들이 연구를 위해 자신의 배아를 정중하게 기증한 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 카렌 마루니아크와 hCG 샘플 처리에 그들의 도움에 대한 CCRM의 임상 실험실뿐만 아니라, 고소 맥코믹과 그녀의 임상 IVF 배아 팀이 배아 수집, 저장, 추적 및 기부에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 자금 조달은 CCRM에 의해 내부적으로 제공되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NORM JECT Luer Lock 멸균 주사기 | VWR | 53548-019 | 100 |
| 3130 또는 3110 Forma Series II 수복 CO2 인큐베이터 | , Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35mm Corning Primaria 조직 배양 접시 | VWR | 62406-038 | 500 5mL |
| 스냅 캡 튜브 | VWR | 60819-295 | 25 |
| 60mm Corning Primaria 조직 팩 문화 접시 | VWR | 25382-687 | 200 |
| 6웰 접시 | Agtech Inc. | D18 | 팩 1, 10 또는 50 |
| 산성 Tyrode 솔루션 | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µ L 피펫 팁 | VWR | 76322-156 | 960 |
| Blast, 배반포 배양 매체 | Origio | 83060010 | 10 mL |
| 희석 용액 | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫 | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/CS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| 배아 배양 파라핀 오일 OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR 튜브 0.2 mL | VWR | 47730-598 | 1,000 |
| Eppendorf PCR 튜브 0.5 mL | 팩 VWR | 89130-980 | |
| 인간 혈장에서 추출한 500 Fibronectin 사례. 액체 .1% 용액 | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µ L |
| 길슨 20 &마이크로; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µ L |
| Gilson 200 &마이크로; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µ L |
| G-MOPS 취급 매체 | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| 취급 매체 | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 웰 챔버 커버 슬립 | Ibidi | 80826 | 상자 당 15 슬라이드 |
| IVC1 / IVC2 | 세포 유도 시스템 | M11-25 / M12-25 | 5-5mL 분취 |
| K 시스템 T47 온난화 플레이트 | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex 멸균 주사기 필터 Durapore PVFD 멤브레인 | Fisher Scientific | SLGVR33RS | 50 |
| 입 조각 | 팩 IVF Store | MP-001-Y | 100개 |
| Oosafe 센터 웰 디쉬 | Oosafe | OOPW-CW05-1 | 500개 케이스 |
| SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| 입 조각용 고무 라텍스 튜빙 | IVF 스토어 | IVFS-NRL-B-5 | 5 |
| 스테레오현미경 | 니콘 | SMZ1270 | |
| 스트리퍼 팁 | 쿠퍼 서지컬 | MXL3-275 | 20/pk 275 &마이크로; m |
| 해동 솔루션 | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL 병 |
| VWR 1-20 µ L 피펫 팁 | VWR | 76322-134 | 960 팩 |
| VWR 1-200 µ L 피펫 팁 | VWR | 89174-526 | 960 세척 |
| 용액 | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
참고문헌
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnen....
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재인쇄 및 허가
