연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

요약

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

초록

세포 외 소포 (EV)는 혈소판 용해 (PL)와 같은 세포 공급원에서 파생 된 화물로 인해 세포없는 치료로서의 잠재력을 증명하기 위해 다른 연구에서 사용됩니다. 치료로 사용되는 경우, EV는 표적 세포를 입력하고 이들로부터의 반응에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이 연구에서, PL 유래 전기 는 골관절염에 대 한 세포 없는 치료로 공부 되었습니다 (OA). 따라서, 방법은 EV를 라벨과 연골 각질에 대한 그들의 섭취량을 테스트하도록 설정되었다. PL 유래 전기는 리포마이트 염료 PKH26로 표지되고, 컬럼을 통해 두 번 세척한 다음, 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 입자 정량화 후 5h에 대한 체외 염증 중심OA 모델에서 테스트한다. 시간당 연골 이출은 고정되고, 파라플료로 절단되어 6 μm 섹션으로 절단되어 슬라이드에 장착하고, 공초점 현미경으로 관찰됩니다. 이를 통해 이 기간 동안 EV가 대상 셀(연골세포)에 진입하는지 여부를 검증하고 직접적인 효과를 분석할 수 있습니다.

서론

골관절염(OA)은 관절 연골^1의세포외 매트릭스의 점진적이고 돌이킬 수 없는 염증 및 파괴를 의미하는 관절 퇴행성 질환이다. 관절염의 다양한 형태는 수많은 치료를 가지고 있지만^2,3,4,이들은 자신의 부작용과 제한된 효능에 의해 제한됩니다. 자가 연골성 이식을 이용한 조직 공학 기술은 조기 OA 연골 병변^4에서부상당한 연골의 재생 치료를 위해 일상적으로 적용된다. 세포 기반 치료법은 주로 연골^3을효과적으로 수리할 수 있는 페노전형안정연골세포 또는 연골로겐이터의 수가 제한되어 있기 때문에 제한된다. 따라서 질병 진행을 방지하고 큰 연골 병변을 재생하는 새로운 치료 전략의 개발이 가장 중요합니다.

세포 외 소포 (EV)는 다른^저자에의해 OA에 대한 치료로 제안되었습니다^5,6. 전기자동차는 대부분의 세포 유형에 의해 분비되는 암골체이며, 세포간 신호에 관....

프로토콜

참고: 이디스바 바이오뱅크(IB 1995/12 BIO)로부터 CEI-IB(IB 3656118 PI)의 프로젝트의 윤리적 승인 후 제도적 가이드라인에 따라 연골 이출을 획득했습니다.

1. 열 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 또는 다음과 같이 열을 평형화합니다.
   1. 열 캡을 제거하고 열을 상위화합니다. 용출하여 저장소 버퍼를 제거합니다.
   2. 인산염 완충식식염(PBS)의 2.5mL로 컬럼을 3회 세척한다. 각 세척 하는 동안, 전체 볼륨을 흡수 하는 열에 대 한 기다립니다.
      참고: 열을 건조시키지 마십시오.
   3. 마지막 세척 후 와 샘플 준비까지 캡으로 컬럼을 덮습니다.

2. EV 라벨링

참고: 이 EV 라벨링 프로토콜은 이전에 설명된^{조건(21,22)을}가진 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 이전에 격리된 PL-EV 샘플을 사용합니다. 그러나 모든 소스의 모든 EV 샘플은 이 프로토콜과 함께 사용될 수 있습니다.

1. 집중 튜브를 사용....

결과

도 1에EV 라벨링 및 업테이크 모니터링에 대한 회로도 개요가 표시됩니다. 표 1에서 NTA에 의해 검출된 입자 농도 및 EV 크기는 컬럼으로 라벨링한 후 두 번 수행된 정화 단계로 인해 공정 중에 EV 농도가 감소함을 보여준다. 그러나, 얻어진 양은 처리를 위해 사용하는 입자의 수의 최적 범위에 있다. 이러한 입자 농도는 골관절염 연골 경질을 치료하는 데 사용되는 PKH-PL-EV 및 제어의 부피를 계산하는 데 사용됩니다.

연골 이출이 EV 또는 대조군으로 처리되면 0, 1, 2, 3, 4 및 5 h의 다른 기간 동안 고정됩니다. 각 그룹은 DAPI를 포함하는 마운팅 배지를 가진 공초점 현미경 검사법을 위해 파라핀화, 슬라이스 및 준비됩니다. 각 시간 시점에서 각 그룹의 대표적인 이미지는 도 2에제시되며, EV가 연골세포에 도달하여 시간이 지.......

토론

EV 이미징은 방출 및 섭취 메커니즘과 같은 EV 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다. 그들의 화상 진찰은 그들의 생체 분배의 감시 및 약동성 속성의 특성을 약 차량으로 허용합니다. 그러나, EV 이미징 및 추적은 그들의 작은 크기 때문에 어려울 수 있습니다, 많은 이미징 장치 및 라벨링 기술은 연구원이 체외및 생체 내 조건에서 전기를 모니터링하는 데 도움이 개발되었지만^23,24,25.

광학 현미경 검사법에 의한 전기 를 추적할 때 두 가지 가능성이 존재합니다: 생체 발광 및 형광 화상 진찰. 둘 다 가시광선 스펙트럼(390-700 nm) 내에서 전기를 감지하는 데 사용됩니다. 생물 발광은 루시파아제 후 생성 된 화학 발광의 일종이다 기판의 산화를 촉매. 이 신호는 감지를 위해 초감도.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Material
1.5 mL 원심분리기 튜브	SPL 생명 과학	PLC60015
1 mL 주사기 BD Plastipak	BD	303174
2-프로판올(이소프로판올)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	를 사용하여 20%로 준비
	SPL 생명 과학
앱솔루트 에탄올 Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	로 96%와 75% 에탄올을 준비하는 데 사용됩니다
3 mm	Scandidact	MTP-33-32
소 세럼  알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	PBS
연골 외식으로	IdISBa Biobank
농축 튜브 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
농축 튜브 500 µ L Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
커버 유리 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX 매체	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
임베디드 파라핀 조직 블록	IdISBa Biobank		서비스 요금
Exo-spin mini-HD 컬럼	세포 안내 시스템	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µ m 주사기 필터	Sarstedt	83.1826.001
Sigma-Aldrich	F-6057		을 사용한 Fluoroshield
M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	0.1 µ의 최종 농도로 원액을 준비합니다. g/&마이크로; L PBS-0.1% BSA
파라포름알데히드	시그마-알드리	8.18715.1000	PBS로 4%로 제조하고 4°°C에 저장; C
페니실린-스트렙토마이신 용액 100x	Biowest	L0022
PKH26 일반 세포막 라벨링용 적색 형광 세포 링커 키트	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 및 Dliuent C 포함
구연산나트륨 이수화물	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNF&알파;	R& D 시스템	210-TA-005	최종 농도 0.01 µ로 원액을 준비합니다. g/&마이크로; L PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Milli-Q 물로 0.1% Triton-0.1% 구연산나트륨 용액을 제조하는 데 사용
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
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NanoSight NS300	&	lambda;= 532 nm에서 내장된 레이저와 카메라 sCMOS	NS300
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