안정화 핀을 가진 마우스 대퇴골의 횡단 골절

골절, 뼈 표면의 연속성의 파손은 인구의 모든 부분에서 발생합니다. 그들은 노화 나 질병으로 인해 깨지기 쉬운 뼈를 가진 사람들에게서 심각 해지고, 취약성 골절의 건강 관리 비용은 5 년 동안 250 억 달러를 초과 할 것으로 예상됩니다 1,2,3,4,5. 골절 복구와 관련된 생물학적 메커니즘을 이해하는 것은 치유 과정을 향상시키기위한 새로운 치료법을 개발하는 출발점이 될 것입니다. 이전의 연구에 따르면 골절시 뼈를 치유 할 수있는 네 가지 중요한 단계가 발생합니다 : (1) 혈종의 형성; (2) 섬유연골 캘러스의 형성; (3) 뼈를 형성하는 부드러운 캘러스의 미네랄화; 및 (4) 치유된 뼈의 리모델링 ^6,7. 골절을 성공적으로 치유하기 위해 많은 생물학적 과정이 활성화됩니다. 첫째, 급성 전염증 반응은 골절 ^6,7 직후에 개시된다. 그 후, 골막이 활성화되고 팽창되고, 연골세포가 연골세포로 분화하여 파쇄된 골 세그먼트 6,7,8,9에 의해 남겨진 틈새를 채우기 위해 성장하는 연골 캘러스를 형성한다. 신경 및 혈관 세포는 새로 형성된 캘러스를 침범하여 복구를 촉진하는 데 필요한 추가 세포 및 신호 전달 분자를 제공합니다 6,7,8,9,10. 굳은 살이 형성에 기여하는 것 외에도, periosteal 세포는 또한 브리징 캘러스에 짠 뼈를 내려 놓는 조골 세포로 분화됩니다. 마지막으로, 파골세포는 새로 형성된 뼈를 리모델링하여 원래의 모양과 라멜라 구조 7,8,9,10,11로 되돌아갑니다. 많은 그룹이 골절 복구의 마우스 모델을 개발했습니다. 마우스에서 가장 초기의 가장 자주 사용되는 골절 모델 중 하나는 Einhorn 접근법으로, 특정 높이¹²에서 다리에 체중이 떨어집니다. 골절을 유도하기 위해 가해지는 각도 및 힘에 대한 제어의 부족은 뼈의 위치 및 크기에 불연속성을 많이 생성한다. 이어서, 관찰된 특정 골절 치유 반응의 변이를 초래한다. 다른 대중적인 접근법은 경골 단피질 결함 또는 스트레스 골절을 생성하기 위한 외과적 개입, 비교적 가벼운 치유 반응을 유도하는 절차^(10,13)이다. 이들 모델의 가변성은 주로 절차¹⁴를 수행하는 사람 때문이다.

여기서, 상세한 마우스 대퇴골 손상 모델은 재현 가능한 부상을 제공하고 대퇴골 골절 복구의 양적 및 질적 평가를 허용하기 위해 휴식에 대한 제어를 허용한다. 특히, 성인 마우스의 대퇴골에 완전한 돌파구가 도입되고 골절 끝을 안정화시켜 뼈 치유에서 물리적 로딩이 수행하는 역할을 설명합니다. 조직을 수확하고 조직학 및 미세 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)을 사용하여 치유 과정의 다양한 단계를 이미징하는 방법 또한 자세히 제공됩니다.

설명 된 모든 동물 실험은 하버드 의료 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 12주령의 C57BL/6J 마우스(수컷 및 암컷)를 이 프로토콜에 사용하였다. C57BL/6J 수컷 및 암컷 마우스는 안정화 핀에 맞을 정도로 넓은 대퇴골로 약 12주령의 피크 골 질량을 달성하며, 이 프로토콜¹⁵에 사용하기에 적합한 균주가 됩니다.

1. 수술 준비

1. 감염의 위험을 최소화하기 위해 외과 용 가위, 직선 포셉, 곡선 포셉, 수술 클램프 및 다이아몬드 커팅 휠 ( 재료 표 참조)을 포함한 수술 장비를 오토클레이브하십시오.
2. 수술 후 회복을 촉진하기 위해 가열 패드에 깨끗한 마우스 케이지를 놓습니다. 히트 패드가 37-45 °C 사이의 온도에 도달하도록 설정하십시오.
3. 마우스를 이소플루란 챔버를 사용하여 마취 하에 놓는다. 유도 산소 흐름을 2 L/min, 이소플루란 유도를 2-4%, 유지 코콘 산소를 2 L/min으로 설정하고, 유지 이소플루란은 1.4%로 설정합니다.
4. 마우스의 호흡이 안정적이며 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하십시오. 각막 긁힘을 방지하기 위해 각 눈에 안과 연고의 얇은 층을 적용하십시오. 마우스를 멸균 패드로 옮기고 코콘을 사용하여 마취를 유지하여 단계 1.3과 동일한 속도로 이소플루란을 연속적으로 전달한다.
   참고: 12주 이상 된 마우스는 어린 마우스의 대퇴골이 너무 얇아서 안정화 핀을 수용할 수 없으므로 사용하는 것이 좋습니다.
5. 마우스를 0.05 mg/kg 체중의 느린 방출 부프레노르핀으로 피하 주사 하십시오 (재료 표 참조).
6. 전기 트리머를 사용하여 대퇴골의 위치에 해당하는 양쪽 허벅지에 2 x 2cm 정사각형을 면도하십시오.
7. 멸균 거즈 또는 면봉을 사용하여 면도한 부위를 소독하여 요오드 층을 퍼뜨린 다음 70% 에탄올로 헹구십시오(그림 1A).

2. 수술

1. 멸균 메스를 사용하여 면도, 소독 된 부위에 5mm 절개를 만들고 피부를 벗겨 내고 근본적인 근막을 노출시킵니다.
2. 직선 포셉과 미세한 가위를 사용하여 대퇴골을 직접 덮고있는 근막을 섬세하게 잡고 잘라 근육을 노출시킵니다. 근막의 5mm 절단은 기본 근육에 접근하기에 충분합니다.
3. 한 쌍의 직선 집게를 사용하여 조직 손상을 최소화하면서 대퇴골에서 근육을 부드럽게 분리하십시오.
4. 대퇴골이 보이면 분리 된 근육과 뼈 사이의 대퇴골 아래에 구부러진 포셉을 밀어 넣으십시오. 포셉을 천천히 열어 근육 분리를 유지하고 대퇴골을 고정시켜 깨끗한 절단을 용이하게하십시오.
   참고: 대퇴골은 그림 1B와 같이 포셉이 유지되지 않을 때 근육과 피부로부터 노출되고 분리되어 있어야 합니다.
5. 저전력 설정에서 핸드헬드 톱을 사용하여 대퇴골 샤프트 중간에 횡단 절단을 만듭니다(사용된 블레이드 및 로터리 툴 키트에 대한 재료 표 참조).
   참고 : 대퇴골이 완전히 절단되면 근위 부분 (엉덩이 뼈에 부착)과 원위 부분 (무릎에 부착되어 있으며 stifle 관절이라고도 함)의 두 가지 골절 끝이 만들어집니다. 한 번의 움직임으로 대퇴골을 자르지 마십시오. 대신, 대퇴골이 완전히 잘릴 때까지 3-5 번 통과하십시오. 이것은 주변 조직이 과열되고 심각한 뼈 파편이 생성되어 치유에 부정적인 영향을 미치지 않도록하는 데 중요합니다.
6. 원위 섹션의 골수 공동에 가이드 바늘 (23 G x 1 TW IM, 0.6 mm x 25 mm) ( 재료 표 참조)을 삽입하십시오. 손가락을 사용하여 무릎 관절을 통해 실을 밀어 넣을 때 바늘을 부드럽게 비틀어줍니다(그림 1C).
   1. 원위 끝에서 가이드 바늘을 제거하고 근위 끝에서 반복하면서 동일한 부드러운 비틀림 동작을 사용하여 가이드 바늘을 엉덩이 관절을 통해 밀어 넣습니다. 가이드 바늘을 근위 끝에 두고 팁이 피부에서 나왔습니다(그림 1D).
      참고: 골절 단부를 안정화시키기 위해, 먼저 가이드 바늘을 사용하여 골절 단부를 통과하는 통로를 만든 다음, 안정화 핀을 이 경로를 통해 나사산하여 골절 단부⁽¹⁴)를 고정시켰다.
7. 안정화 핀(바늘, 27 G x 1 1/4, 0.4 mm x 30 mm)( 재료 표 참조)을 가이드 바늘의 팁에 삽입합니다(그림 1E). 가이드 바늘이 근위 끝의 골수 공동을 빠져 나올 때 안정화 핀이 들어가도록 부드럽게 밀어 넣으십시오.
   1. 가이드 바늘을 버리십시오. 핀셋을 사용하여 원위 단부를 근위 끝과 잡고 정렬하고 2.6으로 만들어진 경로를 사용하여 무릎 관절을 빠져 나올 때까지 원위 골수 공동을 통해 안정화 핀을 계속 나사로 고정시킵니다 (그림 1F).
      참고: 안정화 핀은 이제 엉덩이와 무릎 관절에서 튀어 나와 있어야 합니다.
8. 외과 용 클램프를 사용하여 핀의 끝을 당겨 근위 및 원위 부분을 서로 가깝게 가져 와서 거의 만지지 않도록하십시오. 필요한 경우 골절 끝을 포셉으로 다시 정렬하고 수술 클램프를 사용하여 안정화 핀의 끝을 골절 부위쪽으로 접습니다 ( 재료 표 참조).
   1. 와이어 커터를 사용하여 바늘 바닥에서 플라스틱을 제거하십시오. 클램프를 사용하여 핀의 양쪽 끝을 무딘 상태로 돌려 내부 조직 손상을 방지합니다.
      참고: 골절 끝은 이제 마우스가 부상당한 다리에 무게를 둘 수 있도록 제자리에 잠겨 있습니다. 핀은 골절 끝이 분리될 수 없는 경우 고정됩니다. 와이어 커터를 사용하여 끝을 무디게 할 수도 있습니다. 안정화 핀은 마우스가 안락사될 때까지 연구의 전체 기간 동안 제자리에 있어야 한다. 핀을 분리하려는 시도는 골절 반응을 불안정하게 만들고 동물에게 해를 끼칠 수 있습니다. 핀은 해부시 제거 할 수 있습니다.
9. 직선 포셉을 사용하여 근육을 대퇴골에 재배치하십시오. 구부러진 포셉을 사용하여 피부 끝을 함께 모으고 상처 클립을 사용하여 개구부를 닫습니다.
   참고: 클립으로 피부를 너무 단단히 닫지 마십시오. 그렇지 않으면 마우스가 이 다리에 무게를 두지 않도록 하십시오. 회복 중에 물리적 로딩을 제한하면 치유 과정이 지연 될 수 있습니다.
10. 다른 다리에서 2.2 ~ 2.4 단계를 반복하고 대퇴골 골절을 수행하지 않고 상처를 닫습니다.
    참고 :이 가짜 수술 대퇴골은 대변 통제 역할을합니다.
11. 이소플루란 노출을 철회하고 가열 된 케이지에 마우스를 넣고 10-15 분 이내에 의식을 회복하십시오.
12. 조난 또는 감염의 징후가 있는지 수술 후 5 일 동안 마우스의 활동과 절개 부위를 매일 모니터링하십시오.
    참고 : 동물이 통증의 징후를 보이거나, 먹지 않거나, 뒷다리를 걷는 것을 주저하는 경우, 수의사와상의하고 추가 진통제를 투여하십시오.
13. 수술 후 10 일 후에 상처 클립을 제거하십시오.
    참고: 10일 후에도 상처가 닫히지 않은 것으로 보이면 클립을 제거하기 전에 수의사와 IACUC와 상의하십시오.

3. 조직 수확

1. CO2 흡입을 통해 마우스를 안락사시킨 다음, 자궁경부 탈구를 실시한다.
   참고 :이 절차는 미국 수의학 협회의 안락사 패널과 일치합니다.
2. 가위와 집게를 사용하여 두 마우스 다리에서 피부를 제거하고 엉덩이 뼈에서 대퇴골 머리를 탈구하고 인접한 근육을 잘라 다리를 풀어줍니다.
   참고: 굳은 살이 빠지거나 손상될 수 있으므로 대퇴골 주위의 근육을 너무 많이 제거하지 마십시오.
3. 안정화 핀을 피하고 무릎 관절을 통해 대퇴골을 경골에서 분리하십시오.
4. 대퇴골의 원위 및 근위 부분 주위를 해부하여 안정화 핀의 끝을 노출시킵니다.
5. 하드 와이어 커터를 사용하여 핀의 접힌 무딘 끝을 잘라 핀의 직선 부분 만 남게하십시오. 포셉을 사용하여 안정화 핀을 대퇴골에서 천천히 부드럽게 밀어 내십시오.
   주: 핀이 쉽게 미끄러지지 않으면 굳은 살이 빠져 나와 샘플이 손상될 수 있으므로 힘을 가하지 마십시오. 대신 핀을 회전시키고 섬세하게 제거하십시오. 핀의 제거는 또한 고정 후 더 쉬울 수 있습니다.

4. 조직학 - 알시안 블루 / 에오신 / 오렌지 G 염색

참고: Alcian Blue/Orange G/Eosin 염색은 연골(파란색)과 뼈(분홍색)를 시각화하는 데 일상적으로 사용됩니다. 연골 면적은 전체 캘러스 면적의 비율로 정량화될 수 있다(도 2A,B).

1. 대퇴골을 4°C에서 하룻밤 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시킨다.
2. 고정된 샘플을 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척한다.
3. 샘플을 0.5M EDTA, pH 8.0 상에 2주 동안 천천히 회전하는 진탕기 상에 놓는다. 효율적인 탈석회화를 위해 EDTA 용액을 격일로 변경하십시오.
   참고: 셰이커에는 특정 rpm이 필요하지 않습니다. 액체가 모든 샘플을 덮기 위해 용기에 흐르는지 확인하십시오. 완전한 탈석회화는 대퇴골의 X 선으로 테스트 할 수 있습니다.
4. 파라핀 포매를 위한 샘플을 처리하기 위해 이들을 다음 용액 (각각 1 h)에서 인큐베이션한다: 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, 자일렌, 자일렌, 파라핀, 파라핀.
5. 절편화를 위해 샘플을 파라핀에 임베드한다.
6. 마이크로톰을 사용하여 골절 된 대퇴골의 5-7 μm 두께의 세로 절편을 절단하십시오.
7. 자일렌 2 목욕탕 (각각 5 분)에서 배양하여 절편을 탈파라핀화하십시오.
8. 다음 에탄올 구배(각각 2분)에서 인큐베이션함으로써 절편을 재수화시킨다: 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. 슬라이드를 수돗물에 1분 동안 놓습니다.
10. 보충 파일 1에 언급 된 바와 같이 조직학을 위해 Alcian blue, 산성 알코올, 암모늄 물 및 Eosin / Orange G의 솔루션을 만드십시오.
    참고 : 각 용액의 제안 된 부피는 염색을 위해 슬라이드를 완전히 잠수시키기에 충분해야합니다.
11. 슬라이드를 산성 알코올에 30 초 동안 놓고 알시안 블루에서 40 분 동안 배양하십시오.
12. 물이 맑아질 때까지 흐르는 수돗물 아래에서 약 2 분 동안 부드럽게 씻으십시오.
13. 슬라이드를 산성 알코올에 1 초 동안 빠르게 담그십시오.
14. 단계 4.9에 설명된 대로 헹구십시오.
15. 암모늄 물에서 15 초 동안 배양하십시오.
16. 단계 4.9에 설명된 대로 헹구십시오.
17. 95% EtOH에 1분간 넣고 90초 동안 에오신/오렌지 G에서 배양한다.
18. 70% EtOH, 80% EtOH 및 100% EtOH에 한 번 담그면 슬라이드를 빠르게 탈수시킵니다.
19. 슬라이드를 Xylene에 1분 동안 배치하여 슬라이드를 지웁니다.
20. 이미징을 위해 장착 미디어와 커버슬립을 적용합니다.
    참고: 분자 분석을 위해, RNA와 단백질은 캘러스로부터 분리될 수 있다. 조심스럽게 해부 범위에서 근육을 해부하고 메스를 사용하여 굳은 살을 기본 뼈에서 분리하십시오.

5. 마이크로 CT

참고 : 치유의 후기 단계에서 microCT를 수행하여 단단한 굳은 살과 골절 갭의 미네랄 화를 이미지화하고 정량화 할 수 있습니다. C57BL/6J 마우스에서 캘러스는 일반적으로 광물화되어 골절 후 10일 후(dpf) 후에 microCT에 의해 검출됩니다(그림 2C).

1. 대퇴골을 4°C에서 하룻밤 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시킨다.
   참고 : MicroCT는 EDTA 탈석회화 전에 수행되는 한 조직학에 사용 된 것과 동일한 대퇴골에서 수행 할 수 있습니다 (4.3 단계). 두 기술 모두에 대해 동일한 대퇴골을 사용하는 경우 microCT를 수행하고 샘플을 검색한 다음 4.3 단계로 이동하십시오.
2. 고정된 샘플을 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척하고 70% EtOH에 저장한다.
3. 55kVP의 에너지 레벨과 145μA의 강도에서 7μm의 등방성 복셀 크기로 microCT를 수행합니다( 재료 표 참조).
4. microCT 슬라이스를 윤곽을 윤곽시켜 캘러스를 포함하고 피질골을 제외시킨다.
   참고: 캘러스가 시간이 지남에 따라 미네랄화됨에 따라 임계값을 조정하여 여러 단계에서 캘러스 볼륨을 시각화하고 측정할 수 있습니다.
5. 캘러스 부피의 측정으로서 캘러스 윤곽선에 포함된 뼈 부피를 구한다.
   참고: 파단 갭은 microCT 슬라이스에서 브레이크가 차지하는 거리로 직접 측정할 수 있습니다.

C57BL / 6J 마우스에서 성공적인 수술은 국소 염증 반응 또는 가짜 수술 대퇴골에 대한 periosteal 관여가 거의 없거나 전혀없이 앞에서 언급 한 치유 단계를 완료합니다. 혈종은 수술 후 몇 시간 후에 형성되며, 골막은 연골 형성을위한 골격 전구 인자를 모집하기 위해 활성화됩니다. Prx1+ 중간엽 전구물질과 같은 다양한 세포 집단은 상업적으로 입수가능한 형광 리포터 마우스 모델을 사용하여 복구 과정 동안 추적될 수 있다(도 3). 골절 후 5일 후(dpf)에서, Alcian Blue 염색은 연질 캘러스를 시각화하고 이어서 연골 면적을 정량화하는데 사용될 수 있다(도 2A,B). 광물화는 28dpf에서 microCT에 의해 검출될 수 있다(그림 2C). 미네랄화 된 캘러스의 부피, 골절 갭의 거리 및 기계적 테스트로 측정 된 뼈 강도는 일반적으로 골절 수리의 정량화 가능한 결과로 사용됩니다. 유전자 변형 또는 약물 개입은 회복 과정을 바꿀 수 있으므로 수리의 여러 단계에서 골절을 특성화하기위한 시간 코스 연구를 수행하는 것이 좋습니다. 전체 캘러스는 분자 분석을 위해 해부 될 수 있으며 대측 골 샤프트는 대조군으로 사용할 수 있습니다.  골절 끝이 핀으로 정렬되지 않았거나 적절하게 고정되지 않은 경우 결과 이미지는 골절 부위의 전체 또는 한쪽에 굳은 살이 형성되지 않았음을 보여줍니다 (그림 4).

그림 1: 안정화 핀의 골절 및 삽입 . (A) C57BL/6J 마우스의 오른쪽 다리에 사각형이 면도되어 있습니다. (B) 피부와 근막에 절개를 한 후, 구부러진 포셉을 대퇴골 아래에 고정시켜 근육, 피부 및 뼈를 분리한다. (C) 절단이 이루어진 후, 두 개의 골절 끝이 생성됩니다 : 엉덩이 뼈에 부착 된 대퇴골의 근위 부분과 무릎에 부착 된 원위 부분. 가이드 바늘 (녹색)은 원위 부분에 삽입되고 무릎 관절을 통해 밀려납니다. (d) 가이드 바늘이 원위 부분으로부터 제거되고, 근위 섹션에 삽입되고, 고관절을 통해 밀려난다. (e) 안정화핀(회색 바늘)이 고관절로부터 돌출된 가이드 바늘에 삽입된다. (F) 안정화 핀은 근위 섹션을 통해 원위 섹션으로 밀어 넣고, C의 가이드 바늘에 의해 만들어진 경로를 사용하여 무릎 관절을 통해 밀어 넣습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 대퇴골 골절의 조직학 및 microCT . (A) 대퇴골 골절의 포르말린-고정 파라핀 절편을 5, 10 및 28 dpf에서 수집하고, Alcian Blue/Eosin/Orange G. 스케일 바 = 500 μm로 염색하였다. (b) 연골 면적은 5, 10, 및 28 dpf에서 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. (c) 28dpf에서, 광물화가 관찰되었고, 캘러스 부피 및 파괴 갭은 microCT에 의해 측정될 수 있었다. 스케일 바 = 1,000 μm. SEM에 대한 평균 ± 나타낸 데이터. 미네랄화된 캘러스 부피는 골절 부위에서 피질 뼈 주위를 윤곽을 그리면서 측정하였다. 짙은 회색 영역은 이미지의 미네랄화 된 캘러스를 묘사하는 반면, 피질 뼈 (밝은 회색)는 측정에 포함되지 않습니다. 평균 ± SEM으로 표시된 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 골절 후 Prx1+ periosteal 세포의 확장을 시각화하기 위해 사용된 형광 리포터 모델. Prx1CreER; Rosa26tdTomato 마우스를 tdTomato 발현을 유도하기 위해 80 mg/kg 체중의 타목시펜으로 오일을 매일 주사하였다. 최종 주사 후 사흘 후, 대퇴골 골절이 시작되었고, 마우스를 7 또는 14 dpf에서 희생시켜 Prx1 발현 세포와 그 자손 (Prx1+)이 골절 캘러스 및 확장 골막 내에 위치하는 곳을 추적하였다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 수술 문제로 인한 불규칙한 치유의 예. 골절 끝은 적절하게 정렬되지 않았고 안정화 핀은 이 예에서 대퇴골의 근위 부분을 관통했다. 이러한 오류로 인해 대퇴골이 절단 부위가 아닌 피어싱 (노란색 상자)이있는 굳은 살이 형성되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1 : 조직학에 필요한 솔루션의 구성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.