광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

라만 현미경은 입사광 ^2,3에 반응하여 진동하는 분자에서 발생하는 비탄성 방사 과정인 라만 산란¹을 측정하여 풍부한 화학 지도를 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 라만 맵의 각 픽셀에는 샘플의 화학적 구성과 구조에 대한 직접적인 정보를 전달하는 스펙트럼이 포함되어 있어 고유 진동 대비가 있는 이미지가 생성됩니다. 현재까지 라만 현미경은 다른 이미징 기술이 높은 화학적 특이성과 높은 공간 해상도의 이미지를 생성 할 수 없기 때문에 분자 진동에 대한 미세 분광법 연구의 기준 관점입니다⁴. 뛰어난 화학적 특이성에도 불구하고 라만 산란의 생성 효율은 낮기 때문에 픽셀 체류 시간 연장 또는 고출력 여기가 필요하므로 각각 낮은 획득률과 민감한 샘플과의 비 호환성을 초래합니다.

라만 현미경 검사의 이러한 단일 결핍으로 인해 연구자들은 현미경 검사의 대조 원인으로 일관된 라만 산 란 ^5,6,7,8,9를 적용하게되었습니다. 이것은 몇 배(최대 일곱 개까지)의 크기 차이로 진동 반응을 향상시키는 비선형 광학 공정으로, 고속 화학 이미징(^10,11,12,13)을 가능하게 합니다. 특히, 가장 많이 채택된 두 가지 일관된 라만 산란 기술은 일관된 안티스토크스 라만 산란(CARS)¹⁴ 및 자극된 라만 산란(SRS)¹⁵이다. CARS와는 달리, SRS는 공진 분자의 농도에 대한 선형 의존성을 나타낸다. 그것은 비공명 배경에 면역성이 있으며, 어떤 진동 전이와 무관하지만 분자 진동^16,17의 라만 스펙트럼의 특징적인 로렌츠 모양에 왜곡되는 비선형 효과이다. 따라서, SRS 현미경 검사는 직접적인 정량적 이미지 분석을 가능하게 하는 확실한 라만 정보를 산출한다.

SRS는 샘플의 화학 결합에 대한 직접적인 정보를 제공하는 세 번째 순서, 비선형, 광학 공정입니다. 그것은 일반적으로 근적외선 스펙트럼 영역, 즉 주파수_ωpu 및 ω_S에서 펌프와 스토크스의 시공간 중첩에서 각각 ^10,11,18에서 기인합니다. 이 중첩은 펌프-스토크스 주파수 디튜닝 Ω =_{ωpu-ω S}에서 박동을 생성합니다. Ω이 분자 진동 Ω_R과 일치하면 분자가 공명하여 광장과 분자 사이에 일관된 에너지 전달이 발생합니다. 결과적으로, 분자는 진동적으로 여기된 상태에 도달한다. 이 과정은 펌프 광자의 소멸 (자극 된 라만 손실 [SRL]로 알려진 신호) 또는 스토크스 광자의 수반되는 증폭 (자극 된 라만 이득 [SRG]으로 알려진 과정)을 측정하여 모니터링 할 수 있습니다. SRG 및 SRL은 강렬하고 변동하는 배경(I) 위에 놓이는 작은 신호(ΔI)입니다. SRS 신호(ΔI/I)의 일반적인 값이 10-6-10-4 범위에 있기 때문에 레이저 잡음이 쉽게 가려질 수 있습니다. 신호 대 잡음비(SNR)에 대한 레이저 잡음의 해로운 영향을 완화하고 결과적으로 이미징 속도에 미치는 영향을 완화하기 위해, SRS 검출은 레이저 잡음이 최소값^15,19,20에 도달하는 높은 변조 주파수(>1MHz)에서 변조 전송 기술(예를 들어, 록인 증폭기^, 공진 회로 또는 박스카 평균기)에 의존한다.

기존의 SRS 현미경은 협대역(≈10cm-1) 펌프 및 스토크스 펄스를 사용하여 단일 진동 주파수에서 화학 이미지를 생성하므로 픽셀 유지 시간이 ≈100ns^21,22로 낮은 비디오 속도 이미징이 가능합니다. 그러나, 협대역 SRS 현미경은 단지 몇 개의 진동 주파수에서 샘플을 순차적으로 스캐닝함으로써 화학 지도를 형성하기 때문에, 그 정보는 제한된다⁽²³). 하나 또는 두 개의 진동 콘트라스트를 갖는 SRS 이미지들은 특히 이종 시스템 내에서 겹치는 라만 밴드를 갖는 화학 종을 구별하기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서, 패러다임 협대역 SRS 현미경은 소수의 진동 주파수를 조사하는 것이 화학적 특이성을 방해하고 진동 스펙트럼 내에 인코딩된 풍부한 정보를 무시하기 때문에 SRS의 완전한 잠재력을 이용하지 않는다. 또한 서로 다른 주파수에서 샘플을 순차적으로 스캔하면 픽셀 유지 시간이 연장되어 광손상을 유발하고 연속 이미지 간의 엄격한 공간 공동 등록을 방지하여 모션 아티팩트를 유발할 수 있습니다.

협대역 대응과는 달리, 광대역 SRS 현미경은 각 샘플 스캔(^10,12,24)에서 픽셀당 진동 스펙트럼을 검색한다. 따라서, 광대역 SRS는 상이한 진동 콘트라스트의 엄격한 공간 공동 등록과 함께 하이퍼스펙트럼 이미징을 제공하여, 엄격한 데이터 분석을 가능하게 한다. 이것은 라만 스펙트럼을 통해 표본의 화학 성분을 밝혀 낼뿐만 아니라 상대적 농도를 결정하는 데 도움이됩니다. 스펙트럼이 획득되는 방법에 따라, 광대역 SRS 현미경은 하이퍼스펙트럼 SRS 또는 멀티플렉스 SRS로 분류된다. 하이퍼스펙트럼 SRS에서, 샘플의 스캔된 포인트당 SRS 스펙트럼은 순차적으로 획득되고(즉, 주파수 디튜닝 Ω를 스윕함으로써 검색됨), 연속적인 라만 시프트에서 SRS 신호들을 함께 적층함으로써 SRS 스펙트럼을 구축한다. 라만 스펙트럼은 멀티플렉스 SRS의 여러 진동 모드에서 동시에 측정됩니다. 따라서, 멀티플렉스 SRS 접근법은 변조된 협대역 펄스와 광대역 펄스를 결합하여 SRS 신호를 상이한 주파수에서 구동하고, 협대역 SRS에 필적하는 감도를 갖는 다중 채널 검출기를 사용하여 SRS 스펙트럼을 검출한다.

이 백서는 멀티플렉스 SRS 현미경을 사용하여 이기종 샘플의 화학 맵을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에 채용된 SRS 현미경의 스킴은 도 1에 묘사되어 있고 다른 곳에서 상세히 설명된다(^25,26,27). 간단히 말해서, 10W 평균 전력과 80MHz 반복률로 1040nm를 중심으로 140fs 펄스를 생성하는 상용 모드 잠금 Yb 파이버 레이저가 광대역 SRS 현미경을 구동합니다. 편광 빔 스플리터(PBS)는 기본 빔을 두 개의 브랜치로 분리합니다. 협대역 스토크스 펄스를 생성하기 위해, 기본 빔의 4W를 갖는 하나의 브랜치가 협대역(≈^15cm-1) 빔을 생성하는 에탈론으로 보내지고, 이 빔은 음향 광학 변조기(AOM)로 1.6MHz에서 변조된다. 기본 빔의 6W를 갖는 나머지 분획은 2.8mm 두께의 리튬 트리보레이트(LBO) 결정으로 주파수가 두 배로 증가하고, type-I 위상 정합을 위해 절단된다(θ = 90°, φ = 13.8°). 520nm에서 생성된 2차 고조파 생성은 3.0mm 두께의 LBO 결정(유형 I 상 정합, θ = 90°, φ = 9.8°)을 활성 매질로 사용하는 장치인 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 펌핑하기 위해 X접힌 캐비티로 이동하여 680-910nm 스펙트럼 영역 내에서 파장 조정 가능한 광대역 광 방사선을 전달합니다(그림 2). 이러한 광대역 펄스는 SRS 실험에서 펌프 역할을 하며 프리즘 압축기로 전파되어 현미경 목표에 의해 유도된 분산 효과를 미리 보상합니다.

압축 단계 후, λ/2 웨이브플레이트는 YVO₄ 복굴절 플레이트와 결합되어 두 개의 직교 편광 복제본을 생성하며, 이 복제본은 감지 평면에서의 전자 뺄셈으로 광대역 펌프의 잡음을 상쇄합니다. 이색성 거울은 펌프와 스토크스 빔을 결합하여 직립 현미경으로 보냅니다. 수치 조리개(NA)가 1.27인 침지 목표는 빛을 샘플에 집중시키는 반면, NA가 1.4인 오일 침지 목표는 이를 수집합니다. 검출 단계 전에, 단거리 통과 필터(SPF)는 변조된 스토크를 제거하고, 리트로 구성에서 작동하는 회절 격자는 전송된 광대역 펌프를 분산시킨다. 제2 PBS 2는 펌프 레플리카를 분리하고, 렌즈는 이들을₂ 개의 광다이오드 어레이에 초점을 맞춘다. 이러한 광 다이오드 어레이의 신호는 전자적으로 뺄 수 있으며 자체 제작된 다중 채널 잠금 증폭기(M-LIA)로 전송됩니다. 복조된 신호는 이어서 광 다이오드 어레이 중 하나의 직류(DC) 판독에 의해 정규화되어, SRL 스펙트럼을 생성한다.

예시적인 실험으로서, 우리는 몇몇 잘 알려진 라만 산란기의 혼합물을 이미지화하며, 각각은 독특한 라만 스펙트럼을 가지고 있다. 따라서, 프로토콜은 참조 샘플을 준비하는 방법을 기술함으로써 시작한다. SRL을 감지하면서 협대역 스토크스 펄스를 얻고 광대역 (≈250cm-1) 펌프 펄스, 즉 자체 제작 OPO를 제공하는 광원을 설정하는 방법을 계속 설명합니다. 이 프로토콜은 광학 빔의 정렬 및 최적화를 보여 주며 협대역 Stokes 및 광대역 펌프의 전력 및 스펙트럼과 같은 중요한 매개 변수를 설명합니다. 이 프로토콜은 특별한 광학 요소가 필요하기 때문에 광대역 펌프의 광 경로를 자세히 설명합니다. 또한 펌프-스토크스 펄스 사이의 시공간 중첩을 찾는 방법을 설명하고 상대 강도 잡음(RIN)을 결정하는 실용적인 방법을 보여 주며, 이는 SRS 실험에 가장 적합한 변조 주파수를 정의하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 감지 체인의 작동 원리와 교정에 대해 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 데이터 수집 프로세스, 화학법 및 이미지 처리 파이프라인을 보여줍니다.

1. 시료 준비

참고: 이 프로토콜은 화학적으로 이질적인 혼합물의 농도 맵 및 특징적인 SRS 스펙트럼의 검색을 설명합니다.

1. 샘플을 제조하기 위해, 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA) 마이크로비드의 수성 현탁액으로부터 2 μL를 추출하고( 표 자료 참조) 2 μL 분획을 현미경 커버슬립 상에 부었다.
   1. 깨끗한 피펫 팁으로 폴리스티렌(PS) 마이크로비드의 수성 현탁액에서 2μL를 추출하여 커버슬립의 PMMA 현탁액과 결합합니다. 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 부드럽게 혼합하고 24 시간 동안 건조시킵니다.
      참고: 샘플 표면에서 마이크로비드의 양이 불균형하지 않도록 마이크로비드 현탁액의 농도를 신중하게 일치시키는 것이 중요합니다. PS 및 PMMA 비드의 직경은 각각 10 및 6 μm이다. 이러한 치수는 SRS의 생성 효율을 손상시키지 않으면서 현미경의 높은 공간 분해능을 입증할 수 있게 해줍니다.
2. 물이 마르면 나타나는 평평한 흰색 구슬 층 위에 20μL의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 첨가 한 다음 20μL의 순수한 올리브 오일을 첨가하십시오.
3. 두 번째 현미경 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어를 바르십시오. 매니큐어가 아래를 향하도록 하여 혼합물에 커버슬립을 올려 밀봉하기에 충분한 압력을 가합니다. 그것을 말리십시오.
   참고: 그림 3은 이러한 단계를 통해 얻은 예시적인 결과를 보여줍니다. 제대로 밀봉된 경우, 이 샘플은 최대 석 달까지 지속되어야 합니다.

2. 펌프 및 스토크스 빔 최적화

1. 레이저를 켜고 열적 평형에 도달하게하십시오. 기본 빔에 GDD = -6,000^fs2 의 음의 그룹 지연 분산(GDD)을 적용합니다.
   참고: 이 GDD 값은 OPO를 성공적으로 구동하는 데 중요하며 이 설정에 최적이지만 시스템마다 다를 수 있습니다. 네거티브 GDD는 격자 쌍, 프리즘 압축기, 또는 공간 광 변조기(²⁸)에 기초한 펄스 셰이퍼를 통해 도입될 수 있다.
2. 편광 빔스플리터(PBS₁)로 기본 레이저를 두 개의 브랜치로 분할합니다. 협대역 스토크스 펄스를 얻으려면 4W의 한 브랜치를 에탈론으로 안내하십시오. 좁은 스펙트럼 라인이 얻어지고 펄스 스펙트럼의 피크에서 중심이 될 때까지 에탈론을 약간 회전시킨다( 그림 2의 빨간색 곡선 참조).
   참고 :이 에탈론은 29의 유효 기교와 1,040nm에서 29.8nm의 자유 스펙트럼 범위를 가지고 있습니다.
3. 변조된 스토크스 펄스를 얻으려면 협대역 빔을 acousto -optical 변조기로 보냅니다.
   참고: 그림 4A에 표시된 것처럼 1차 확산 빔은 100% 변조를 경험하지만 0차 차수는 50%에 불과합니다. 따라서, 임의의 SRS 신호를 발생시키지 않고 샘플 광손상을 유도할 수 있는 강한 변조되지 않은 빔으로 샘플을 비추는 것을 피하기 위해 일차적인 것을 채용하는 것이 바람직하다.
   1. 변조 효율을 최적화하려면 렌즈_f1 과_f2 사이의 거리를 변경하십시오(그림 4B). 광 다이오드로 변조된 빔을 측정하고 오실로스코프로 프로파일을 기록합니다.
   2. 오실로스코프 판독값의 진폭과 기준선 사이에서 최대 대비가 달성될 때까지_f1 과_f2 사이의 거리를 변경하십시오.
      참고: 이 렌즈 쌍은 시준기로 작동하는 것이 아니라 AOM의 크리스털에 효과적인 초점 스폿을 생성합니다.
   3. 세 번째 렌즈 f₃ 을 배치하여 Stokes 빔의 허리를 미세 조정하여 현미경의 초점면에서의 상호 작용 볼륨을 변경하고 결과적으로 SRS 신호를 최적화하십시오.
      참고: 스토크스 빔은 이 프로토콜에서 1.6MHz에서 변조되었습니다.
4. 기본 빔의 나머지 6W의 광전력을 리튬 트리보레이트(LBO) 결정(LBO 1, θ = 90°_, φ = 13.8°)에 집중하여 초고조파 생성(SHG)을 통해 기본 빔을 주파수-배가시킨다(그림 5A).
   1. SHG 효율을 최대화하려면 크리스털을 약간 회전시켜 φ각을 변경합니다(그림 5B). LBO₁ 을 최적화하여 최소 2.5W의 SHG를 확보하십시오.
5. LBO₂ 의 φ 각도를 조정하여 신호 빔의 생성 효율을 극대화하십시오.
   참고: 렌즈 f₁, f₂ 및 f₃ 의 초점 거리는 SHG 빔과 OPO 캐비티를 모드 일치시키기 위해 신중하게 선택되었습니다. 따라서, 이들 렌즈의 초점 거리는 다른 설정에 따라 달라질 것이다. OPO 캐비티 내의 잔류 분산으로 인해, 캐비티 길이의 약간의 변화는 신호 빔의 스펙트럼의 시프트를 유도한다.
   1. 캐비티 길이를 조정하여 1,040nm의 협대역 스토크와 함께 1,373-5,090cm-1 내에서 주파수 디튜닝을 생성할 수 있는 펌프 스펙트럼을 얻으십시오. 이 범위는 CH 스트레칭 스펙트럼 영역 (2,800-3,050 ^cm-1)의 진동을 포함합니다. 그림 2의 파란색 스펙트럼을 참조하십시오.
6. 여기 현미경 목표에 의해 유도된 분산 효과를 보상하려면 광대역 펌프를 프리즘 압축기로 보냅니다. 펌프를 정점을 통해 프리즘 A에 입력하고 분산 된 펌프를 프리즘 B의 정점 쪽으로 안내하십시오. 필요한 음의 분산량을 정의 한 다음 프리즘의 양봉료 L 사이의 거리를 적절하게 설정하십시오.
   참고: 도 6은 프리즘(²⁹)의 배열을 도시한다. 이 경우 GDD에 대한 보상은 -12,800^{fs 2}≈ 설정되었습니다. 따라서 L = 1.26 m.
   1. 브루스터 컷 프리즘을 사용하십시오.
      1. 펌프 빔의 편광이 프리즘의 삼각형 평면(상단/하단 연마되지 않은 면) 내에 있는지 확인하십시오.
      2. 펌프_{빔의 입} 사각 θ가 브루스터 각도와 일치하는지 확인하십시오.
      3. 프리즘 A의 출구면이 프리즘 B의 입구면과 평행한지 확인하십시오.
   2. 보상될 광대역 펄스의 GDD를 추정하기 위해, 단일 파장 λ1에서 SRS 신호를 측정하고, 최대 SRS(λ1)가 획득되는 펌프-스토크들 사이의 시간 지연_τ1을 기록한다. 제 2 파장 λ2에 대해 이 절차를 반복하고, SRS(λ2)가 최대였던 시간 지연_τ2를 다시 등록한다.
      참고: GDD는 각도 주파수에 대한 그룹 지연의 미분으로 정의되기 때문에, 전술한 측정은 광대역 빔의 GDD의 추정을 허용한다(Eq[1]).
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7. λ/2 웨이브플레이트를 사용하여 펌프 빔의 편광을 45°로 설정합니다. 편광 펌프를 길이 13.3mm의 YVO₄ 플레이트로 안내하여 이 복굴절성 결정의 빠른 축을 수직으로 설정합니다.
   참고: YVO₄ 플레이트를 통과할 때, 펌프 펄스는 공선으로 전파되는 두 개의 직교 편광 복제본으로 분할되지만 이들 사이에 지연 Δt ≈ 10ps를 유지합니다. 이러한 지연은 복굴절성 결정의 두께 및 굴절률의 함수이다. 이후, Stokes 펄스의 동일한 편광 상태를 갖는 펌프 복제본은 "신호"라고 불리고 직교 상태를 갖는 것은 "참조"로 불릴 것이다. 인라인 균형 잡힌 검출이라고하는이 기술의 세부 사항은 이전에³⁰ 번 설명되었습니다.
8. 펌프와 스토크스 빔을 이색성 거울과 결합하고 한 쌍의 형광 핀홀을 사용하여 조심스럽게 정렬하여 둘 다 공선으로 전파되도록하십시오. 빔을 감쇠시키고 렌즈를 사용하여 빠른(최소 100MHz 대역폭) 광 다이오드에 초점을 맞춥니다.
   1. 펌프를 차단하고 고대역폭 디지털 오실로스코프로 단일 Stokes 펄스를 측정합니다. 레이저의 트리거 신호를 오실로스코프 측정을 위한 클록 소스로 사용하십시오. 광 다이오드 전압이 최대값에 도달하는 평균값을 결정합니다.
   2. 스토크스 빔을 차단하고 펌프 펄스에 대해이 절차를 반복하십시오. 펌프(Stokes) 빔의 펄스가 스토크스(pump) 펄스와 대략 동시에 도착할 때까지 펌프(Stokes) 빔의 광 경로를 늘리거나 줄입니다.
      참고: 이것은 두 팔 사이의 광학 경로 차이의 일치에서 최대 수 밀리미터의 정밀도를 보장해야 합니다.
   3. 광 다이오드를 제거하고 펌프-스토크스 광자 사이의 합 주파수 생성(SFG)에 적합한 절단 각도를 갖는 비선형 크리스털을 배치합니다.
      참고: 여기에 사용된 비선형 결정은 유형 I 위상 정합, θ = 90°, φ = 9.8°를 위해 절단되었습니다. 비선형 결정의 광축은 스토크스 및 신호 펄스의 편광과 평행해야 합니다.
   4. 펌프/스토크스 빔을 약간 비공선형으로 만들고 위상 정합으로 인해 펌프의 SHG와 스토크스 빔 사이에 있는 신호인 SFG가 될 때까지 지연 라인을 이동합니다. 신호가 발견되지 않으면 크리스털에 있는 두 빔의 공간적 중첩을 확인합니다.
      참고: SFG는 파란색으로 이동하므로 육안으로 쉽게 볼 수 있어야 합니다.
   5. 예상치 못한 어려움이 있는 경우 저역 통과 필터를 배치하여 펌프와 스토크스 및 각각의 SHG를 제거하고 분광계로 SFG를 측정합니다(그림 7A). SFG가 최대 강도에 도달하는 시간 지연(비선형 신호 생성에 필요한 이상적인 시공간 중첩을 결정하는 값)을 찾아 지연 선을 고정합니다(그림 7B).
9. 보정된 카메라로 빔 프로파일을 측정합니다. 또는 적외선 카드를 사용하여 눈으로 직경을 추정하십시오. 두 개의 망원경을 사용하는데, 하나는 펌프용이고 다른 하나는 스톡스 빔용입니다. 이러한 망원경을 사용하여 빔 직경을 여기 목표의 뒤쪽 조리개와 일치시킵니다.
   참고: 이 절차는 설정의 최대 공간 해상도를 보장합니다.
   1. SRS 신호가 얻어지면 펌프 빔의 망원경을 사용하여 직경을 조정하고 레일리 범위를 변경하며 결과적으로 현미경 초점에서 상호 작용 부피를 변경하십시오. 최대 SRS가 달성되면 중지하십시오.
10. 광 다이오드를 사용하여 펌프(Stokes) 빔의 강도를 측정하고, 광 다이오드의 응답성으로 검출기의 활성 영역에 충돌하는 평균 전력을 계산합니다.
    1. 고대역폭 광 다이오드를 사용하는 경우 전자 저역 통과 필터를 연결하여 상수 또는 DC 구성 요소만 가져옵니다. δP(f)를 측정하려면 고대역폭 광 다이오드의 출력(저역 통과 필터 분리)을 록인 증폭기의 입력에 연결합니다. 잠금 출력을 서로 다른 복조 주파수에 저장하고 광 다이오드의 응답성을 사용하여 V에서 W로 변환합니다.
       참고: 상용 잠금 증폭기에는 δP(f)를 측정하기 위한 도구가 내장되어 있습니다(예: LabOne에 주파수 스위퍼(³¹)에 통합된 취리히 인스트루먼트).
    2. 빔의 RIN을 측정한 후, 레이저를 끄고 전자 잡음(즉, 검출기에 어떠한 빛도 없이 계산된 RIN을 측정한다)을 측정한다.
       참고: RIN이 샷 노이즈가 아닌 레이저 변동에 의해 제한되는 경우, 이 어두운 측정은 측정에 사용되는 계측기를 진단하는 데 도움이 됩니다. 전자 잡음이 레이저의 RIN만큼 높으면 레이저의 RIN을 측정하는 데 사용할 수 없습니다. 초저잡음 증폭기는 전자 잡음을 줄이기 위해 사용되어야 할 수 있다.
    3. RIN이 레이저 변동이 아닌 샷 노이즈에 의해 제한되는 경우, 검출기에 더 많은 광학적 전력을 비추십시오. 그림 8을 참조하십시오.

3. SRS 이미징을 위한 스펙트럼 검출 설정

1. 펌프와 스토크스 빔을 현미경으로 안내하십시오.
2. 섹션 1에서 논의된 샘플을 배치하고, 펌프 빔을 정렬하는 데 도움이 되는 비드가 없는 영역을 찾으십시오. 카메라를 사용하여 펌프(Stokes)를 차단하면서 스토크스(펌프) 빔의 반사 프로파일을 측정합니다. 현미경 바로 전에 거울로 레이저 반점의 위치를 조정하십시오.
   참고: 가장 높은 SRS 생성을 얻으려면 SRS 생성이 완벽하게 겹쳐야 합니다. 그림 9는 (A) 펌프, (B) 스토크스, 및 (C) 두 빔이 현미경의 초점면에서 완벽하게 겹쳐진 것을 보여준다.
3. 흥분 및 수집 목표를 공초점으로 만드십시오.
   참고: 무한대 보정 목표를 사용하면 펌프를 샘플 평면에 집중하면 수집 대상의 뒤쪽 조리개에서 시준된 빔이 생성됩니다.
   1. 단거리 통과 필터를 넣어 변조 된 스토크를 제거하고 펌프 빔을 격자로 안내하십시오. 격자 뒤에 렌즈를 놓아 분산된 빔을 검출기에 초점을 맞춥니다.
      참고: 격자 방정식은 선형 분산(즉, 주어진 초점 거리 ^f32의 렌즈를 갖는 검출기 평면에서 mm당 얼마나 많은 nm)을 결정하는 데 도움이 될 것이다. 격자 방정식은 격자의 홈 주기성 d, 입사각 α, 회절각β, 회절파장 λ, 및 회절차수 m(Eq[2])에 관한 것이다.
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4. 균형 잡힌 감지를 위해 기준의 스펙트럼과 펌프 빔을 따라 전파되는 신호 복제본을 측정하십시오.
   참고: 격자 이후의 펌프 빔의 공간 프로파일은 길이에 따라 광대역 펌프의 다른 스펙트럼 성분을 포함하는 라인입니다. 펌프 라인의 각 스펙트럼 성분은 구형 렌즈에 의해 거리 f 에 초점을 맞출 것이다(단계 3.1-3.2 참조).
   1. 분산된 펌프를 클리핑하지 않으려면 구형 렌즈를 격자에 최대한 가깝게 두십시오. 구형 렌즈 바로 뒤에 PBS를 넣어 펌프 복제본을 분리한다.
      참고 : 여기서 편광 큐브 빔 스플리터는 이러한 종류의 편광자가 펌프 빔의 편광을 스크램블하지 않기 때문에 사용되었습니다. 또한 서로 다른 펌프 복제본을 효과적으로 분리하고 광대역 펌프 클리핑을 피할 수 있을 만큼 충분히 클 수 있습니다. PBS는 신호 레플리카(s-polarized)를 반사하고 기준 레플리카(p-polarized)를 전송할 것이다.
   2. 한 쌍의 스티어링 미러를 사용하여 신호를 안내하고 해당 감지기를 참조합니다(그림 1).
      참고: 이상적인 균형 잡힌 구성에서 신호 및 참조 복제본은 동일한 광 전력을 가져야 합니다.
   3. 펌프 빔에서 잡음을 제거하려면 신호를 측정하는 광 다이오드 어레이의 채널을 기준 검출기의 해당 채널과 상관 관계를 지정합니다. 따라서 신호 및 기준 광 다이오드 어레이의 n^번째 광 다이오드가 신호 및 기준 복제본의 동일한 스펙트럼 구성 요소의 광 전력을 측정하는지 확인하십시오.
      참고: 도 8은 예시적인 RIN 스펙트럼을 도시한다.
5. 두 광 다이오드 어레이 간의 스펙트럼 정합을 보장하려면 격자와 PBS 사이에 작은 슬릿 또는 아이리스를 배치하여 분산된 펌프를 공간적으로 필터링합니다. 펌프 복제본의 하나의 스펙트럼 구성 요소를 제외한 모든 스펙트럼 구성 요소를 클립하여 전송 된 광선을 참조 및 신호 광 다이오드 어레이의 n^번째 검출기에 집중시킵니다. 언급 된 스티어링 미러를 사용하여 다른 감지 채널의 상관 관계를 조정하십시오.
6. 이 시점에서 SRS 현미경을 시작하십시오. 이를 위해 스톡스를 변조하고, 래스터-스캔 샘플을 스캔하고, 펌프 스펙트럼(ΔI)에서 해당 DC 스펙트럼(I)으로 변조 전송을 획득하여 각 픽셀로부터 정규화된 SRS(ΔI/I) 스펙트럼을 얻는다. 행(x)과 열(y)에 샘플의 스캔된 위치가 포함된 입체 행렬을 생성합니다. xy 평면에 직교하는 각 벡터(z) 상에 SRS 스펙트럼을 저장한다.
   참고: 도 12는 SRS 하이퍼스펙트럼 데이터의 구조를 보여준다.
   1. 스토크스 빔의 전력을 65mW로, 광대역 펌프 빔의 전력을 20mW로 설정합니다. 실험에 이상적인 통합 시간을 설정합니다.
      참고: 여기서, 통합 시간은 44 μs; 그러나, 픽셀 체류 시간은 느린 압전 스캐너 때문에 1ms였다.

4. 하이퍼스펙트럼 SRS 데이터의 화학측정

1. 다변량 곡선 분해능 분석을 사용하여 샘플의 다양한 화학 성분을 분리합니다. Tauler, de Juan 및 Jaumot³³의 링크에서 GUI를 다운로드하십시오.
   참고: 여기에서는 Tauler와 동료가 개발한 다변량 곡선 해상도-교대 최소 제곱(MCR-ALS) MATLAB 프로그램이^34,35개를 사용했습니다. SRS 데이터에 대한 MCR-ALS의 적용에 대해서는 ^36,37을 참조하십시오. 알고리즘에 대한 자세한 논의는 ³⁸을 참조하십시오.
2. MATLAB에서 SRS 하이퍼스펙트럼 데이터 큐브를 SRS 스펙트럼을 포함하는 행이 있는 행렬 D로 재구성합니다. 펼쳐진 SRL 하이퍼큐브 D가 샘플의 화학적 구성성분의 농도 C와 스펙트럼 프로파일 S의 선형 조합이라고 가정한다(즉, D= CS ^T+ E, 여기서 E는 실험 오차를 포함하는 매트릭스이고, 위 첨자 ^T는 매트릭스 전치를 나타낸다).
3. C와 S를 분리하기 위해 데이터의 주요 구성 요소를 얻습니다. 섹션 1에서 논의 된 샘플에는 DMSO, 올리브 오일, PMMA 및 PS의 네 가지 종, 즉 네 종과 배경 소음을 설명하기 위해 다른 종을 검색하도록 프로그램을 구성한다는 것이 선험적으로 알려져 있습니다. 종 수가 많거나 적은 다른 표본이 있는 경우 그에 따라 프로그램을 구성하십시오.
   참고 : 프로그램은 스펙트럼 데이터의 단수 값 분해를 수행하여 순수 스펙트럼 S의 초기 추측으로 사용합니다.
   1. 대안적으로, 알려진 스펙트럼 트레이스(예를 들어, 물질의 자발적인 라만 스펙트럼)를 포함하는 매트릭스로 프로그램을 공급한다.
      참고 : 순수 스펙트럼의 초기 추정치를 사용하여 프로그램은 C = DS (S T S) - 1 및 S T = (C T C) ^- 1 C T D를 계산합니다. C와 S의 새로운 값은 교대로 최소 제곱 알고리즘으로 최적화됩니다.
4. SRS는 음수가 아닌 신호이므로 교대로 최소 제곱 알고리즘을 제한하여 양수 값만 전달하도록 합니다.
   참고: 최적화된 C와 S를 사용하면 프로그램이 원래 데이터 D와 비교할 데이터 세트인 새 행렬 D*= CS^T를 구성할 수 있습니다. 프로그램은 D*와 D의 차이가 정의될 수 있는 임의의 임계값보다 작을 때까지 이러한 단계를 자동으로 반복합니다.
5. C 및 S를 플롯하여 샘플의 화학적 구성성분의 화학적 이미지 및 특징적인 스펙트럼을 획득한다.

도 3은 PS, PMMA 및 올리브 오일과 함께 이 프로토콜을 사용하여 수득된 예시적인 결과를 도시한다. LBO1 의 이러한 회전은 SHG 필드에서 경험하는 굴절률을 변화시켜 위상 속도를 직접 수정합니다. SHG 필드의 위상 속도가 LBO1에서 유도된 비선형 분극의 위상 속도와 일치할 때, 비선형 생성 필드와 비선형 분극은 위상에 있게 되어 강렬한 SHG 방사로 이어진다. 즉, LBO1 의 φ각을 조정하면 사용자가 SHG에 대한 이상적인 위상 정합 조건을 얻을 수 있습니다. 여기서 타입 I 위상 정합 결정이 사용됨에 따라, SHG 빔의 편광은 기본 빔의 편광과 직교할 것이다(도 5B).

도 8은 이 프로토콜에 사용된 광원의 RIN과 레이저 잡음에 대한 근본적인 한계를 설정하는 전자와 광자의 양자 성질의 결과인 샷-노이즈 한계를 보여준다. 샷 노이즈 제한 RIN은 Eq (3)에 의해 나타낸 바와 같이 계산 된다.

(3)

여기서 h 는 플랑크의 상수이고 ν는 광 주파수입니다. 따라서, 샷 노이즈는 전자 설계에 유용한 지침을 제공합니다.

도 11A 및 도 11C는 균형 및 불균형 스펙트럼의 예시적인 데이터를 도시한다. 당연히 균형 잡힌 탐지의 효과는 실험의 최종 결과, 즉 화학지도에 영향을 미칩니다. 도 11B 및 도 11D는 각각 불균형 및 평형 조건에서의 합성 이미지를 도시한다. 기술된 프로토콜을 성공적으로 구현하면 이종 샘플의 상이한 화학적 구성성분을 확인 및 국소화하고 이들의 특징적인 SRS 스펙트럼을 추출하는 데 도움이 될 것이다. 도 12의 하이퍼스펙트럼 데이터를 화학학적 분석에 적용하면 도 13을 제공한다. 도 13A는 샘플의 상이한 화학적 구성성분들의 농도 맵들의 복합체를 도시하는 반면, 도 13B는 이들의 특징적인 SRS 스펙트럼을 도시한다. 도 13A에 도시된 데이터는 사용자가 샘플의 상이한 구성성분을 쉽게 식별할 수 있게 할 뿐만 아니라 더 많은 정량적 분석을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, 농도 맵을 사용하여 각 화학 종의 분수 농도의 평균을 계산할 수 있습니다 : 38 % DMSO, 25 % PMMA, 14 % PS 및 22 % 올리브 오일.

그림 1: 이 프로토콜에 사용된 광대역 SRS 현미경의 회로도. 약어: PBSx = 편광 빔스플리터; SHG = 초고조파 생성 모듈; OPO = 광학 파라메트릭 발진기; AOM = acousto optic modulator; SPF = 단거리 통과 필터; M-LIA: 다중 채널 잠금 증폭기; DM = 이색성 거울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 조정 가능한 광대역 펌프(파란색)와 협대역(빨간색) 스토크스 빔의 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 화학적으로 불균질 샘플의 브라이트필드 이미지. 기존의 현미경 검사는 상이한 구성성분들이 구별되는 것을 허용하지 않는다는 것을 주목하라. 스케일 바 = 100 μm. 약어: PS = 폴리스티렌; PMMA = 폴리메틸 메타크릴레이트; DMSO = 디메틸 설폭사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 협대역 스토크스 펄스의 변조 . (A) 투명한 파란색 트레이스는 0번째 확산 빔을 나타내고, 검은색 트레이스는 해당 1차 시퀀스를 보여줍니다. (B) 여기 목표에 도달하기 전에 1차 확산 빔의 변조 효율을 최적화하고 스토크스 빔의 스폿 크기를 미세 조정하기 위한 광학 설정. 약어: AOM = acousto 광학 변조기; fx = 렌즈 X의 초점 거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: OPO를 구동하는 데 필요한 비선형 광학 프로세스. (A) SHG 상호 작용의 형상. ω1에서 두 개의 기본 광자는 재료 시스템이 접지 상태로 뛰어 내려 ωSHG에서 광자를 방출하는 고에너지 가상 레벨로 재료 시스템을 가져옵니다. (b) SHG 실험의 반응식. (C) SHG 및 OPO 설정의 회로도. (d) DFG 상호작용의 지오메트리. ωSHG 광자는 신호 (ω신호)와 아이들러 (ωIdler) 광자로 분할됩니다. 신호 빔의 이득은 신호 광자를 피드백하고 캐비티에서 공진하게함으로써 달성됩니다. (e) DFG 실험의 반응식. 약어: SMx = 구형 거울 (R = 75 mm); OPO = 광학 파라메트릭 발진기; SHG = 초고조파 생성 모듈; DFG = 차이-주파수 생성; LBO = 리튬 트리보레이트; OC = 오일 응축기; DM = 이색성 거울; fx = 렌즈 X의 초점 거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 프리즘 압축기의 형상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 시공간 중첩을 최적화하기 위한 합계 주파수 생성 . (A) 펌프와 스토크스 사이의 SFG와 스크린에 충돌하는 각각의 SHG 사이. 여기서 렌즈는 펌프를 집중시키고 스토크스 빔은 크리스탈에 초점을 맞추었고 저역 통과 필터는 이를 제거했습니다. (B) 시간 지연의 함수로서 펌프와 스토크스 사이의 SFG의 강도. SRS 설정의 시간 제로를 SFG를 최대화하는 위치에 설정합니다. B 에서의 교차 상관관계의 비대칭성은 스토크스 빔의 에탈론에 의해 야기된 시간적 프로파일에 기인한다. 약어: SFG = 합계 주파수 생성; SHG = 초고조파 생성 모듈; SRS = 자극된 라만 산란 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: RIN 스펙트럼. 녹색으로 강조 표시된 밴드는 SRS 실험에 가장 적합한 스펙트럼 영역을 보여줍니다. 이 대역 내의 모든 주파수에서 Stokes 빔을 변조하면 SRS 신호에 대한 레이저 잡음의 영향이 가능한 가장 낮을 수 있습니다. 약어: RIN = 상대 강도 잡음; SRS = 자극된 라만 산란 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 빔 프로파일 . (A) 펌프, (B) 스토크스, (C) 펌프 및 스토크스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 분산 격자 및 광 다이오드 어레이 검출기에 대한 형상을 가정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11. 균형 잡힌 탐지의 효과. 스펙트럼(A, C) 및 화학 이미지(B, D)에 대한 영향. 패널 (B) 및 (D)에 도시된 복합체는 실험의 최종 결과(즉, 하이퍼스펙트럼 데이터의 화학학적 분석 후)이다. 자세한 내용은 프로토콜 섹션 4를 참조하십시오). 스케일 바 = 10 μm. 약어: SRS = 자극된 라만 산란 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12: 광대역 SRS 현미경으로 획득한 대표적인 SRS 하이퍼큐브. xy 평면은 스캔된 위치의 좌표를 저장하는 반면, z를 따른 각 벡터는 SRS 스펙트럼을 등록합니다. 약어: SRS = 자극된 라만 산란 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 13: 하이퍼스펙트럼 SRS 데이터의 화학측정 분석 . (A) 샘플의 상이한 구성성분들의 농도 맵의 합성. (B) 화학종의 특징적인 스펙트럼. 두 패널 모두에서 노란색 : 올리브 오일, 파란색 : DMSO, 시안 : PS 및 오렌지 : PMMA. 스케일 바 = 20 μm (A). 약어: SRS = 자극된 라만 산란 분광법; PS = 폴리스티렌; PMMA = 폴리메틸 메타크릴레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

G. C.는 광대역 SRS 현미경 기술을 상용화하는 것을 목표로하는 Cambridge Raman Imaging이라는 회사와 계약을 체결했다고 선언합니다. 다른 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.