Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

방광암은 남성에서 네 번째로 흔한 암이며 미국에서 매년 80,000 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다¹. 백금 기반 화학 요법은 삼십 년 이상 진행성 방광암 환자를위한 치료의 표준이었습니다. 방광암 치료의 풍경은 최근 FDA (Food and Drug Administration)의 면역 요법 (항 PD-1 및 항 PD-L1 면역 체크포인트 억제제), 에르다 피티닙 (섬유 아세포 성장 인자 수용체 억제제) 및 엔포르투맙 베도틴 (항체 - 약물 접합체)^2,3,4의 승인으로 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 화학요법 또는 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 승인된 바이오마커는 이용가능하지 않다. 방광암 진행을 유도하는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 다양한 치료 양식에 대한 예측 바이오마커를 개발할 수 있는 유익한 전임상 모델을 생성해야 할 절실한 필요성이 있습니다.

방광 번역 연구의 주요 장애물은 인간 방광암 발병기전과 치료 반응 ^5,6을 재검토하는 전임상 모델의 부족이다. 시험관내 2D 모델(세포주 또는 조건부로 재프로그램된 세포), 시험관내 3D 모델(오가노이드, 3D 프린팅) 및 생체내 모델(이종이식편, 발암물질-유도, 유전자 조작 모델 및 환자 유래 이종이식편)^2,6을 포함하는 다수의 전임상 모델이 개발되었다. 유전자 조작된 마우스 모델(GEMMs)은 종양 표현형의 분석, 후보 유전자 및/또는 신호전달 경로의 기계론적 조사, 치료 반응의 전임상 평가^6,7을 포함하여 방광암 생물학의 많은 응용에 유용하다. GEMMs는 하나 이상의 종양 억제 유전자에서 유전적 결실을 조절하기 위해 부위-특이적 재조합효소(Cre-loxP)를 이용할 수 있다. 여러 유전자 결실로 원하는 GEMM을 생성하는 과정은 시간이 많이 걸리고 힘들고 비용이 많이 듭니다⁵. 이 방법의 전반적인 목표는 삼중 플록스 대립 유전자 (Trp53, Pten, 및 Rb1)⁸을 운반하는 정상 마우스 비뇨 생식기 세포로부터 방광 삼중 녹아웃 (TKO) 모델을 확립하기위한 생체외 Cre 전달의 신속하고 효율적인 방법을 개발하는 것입니다. 생체 외 방법의 가장 큰 장점은 빠른 워크 플로 (수년간의 마우스 번식 대신 1-2 주)입니다. 이 글에서는 플록스 대립유전자, 생체외 아데노바이러스 형질도입, 오가노이드 배양, 면역적격 C57 BL/6J 마우스에서의 시험관내 및 생체내 특성화를 갖는 정상 비뇨생식기 세포를 수확하기 위한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 플록스 대립 유전자의 임의의 조합을 보유하는 면역적격 마우스에서 임상적으로 관련된 방광암 오가노이드를 생성하는데 추가로 사용될 수 있다.

모든 동물 절차는 뉴욕 버팔로의 Roswell Park Comprehensive Cancer Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (1395M, Biosafety 180501 및 180502)의 승인을 받았습니다.
참고: 같은 날에 1-3단계를 수행하십시오.

1. 마우스 방광의 해부

1. 해부 준비
   1. 가위, 포셉, 멸균 DPBS를 포함한 모든 멸균 기구를 35mm 배양 접시, 70% 에탄올, 멸균 거즈 및 깨끗한 종이 타월에 준비하십시오. 해부 영역의 모든 표면을 청소하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 수컷 삼중 플록스 마우스 Trp53 f^/f: Pten f/f: Rb1^f/f (4마리 마우스, 10주령)를 생성^한다.
2. 안락사와 절개
   1. 마우스를_CO2 질식에 의해 2.0 L/min 유속을 사용하여 안락사시키고, 이어서 자궁경부 탈구를 가한다. 해부 부위를 70 % 에탄올로 청소하고 깨끗한 종이 타월로 덮으십시오.
   2. 마우스를 해부 부위의 거즈 위에 놓습니다. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 해부 가위를 사용하여 방광을 노출시키는 중간 선 복부 절개를 만듭니다.
3. 방광 해부
   1. 포셉을 사용하여 방광을 잡고 부드럽게 당겨서 양측 요관 접합부가 확인되도록하십시오. 가위를 사용하여 두 요관 개구부 사이의 경계선을 따라 방광 안저부를 제거하십시오.
   2. 방광을 DPBS 2mL의 멸균 접시에 옮깁니다. 지방과 결합 조직을 제거하고 방광을 멸균 된 DPBS 2 mL로 새 접시에 넣으십시오. 이때 아데노바이러스를 -80°C에서 꺼내어 얼음 위에 보관한다.

2. 비뇨생식기 세포의 해리

1. 세포 해리를 위한 제조
   1. 포셉, 수술용 메스(손잡이가 달린 10개의 칼날), 35mm 배양 접시에 멸균 DPBS, CCM(-)으로 정의된 숯이 벗겨진 FBS가 없는 완전한 배양 배지, 콜라게나제/히알루로니다제 혼합물, 트립신 대체용 재조합 효소, 10μM 신선한 Y-27632가 있는 DPBS의 10% 숯 제거 FBS, 100μm 멸균 세포 스트레이너 및 15mL 원심분리 튜브를 포함한 모든 멸균 기구를 준비하십시오.
      참고: 완전 배양 배지(CCM)는 제공된 성장 인자 및 5% 숯 제거 FBS, 1% L-글루타민 대체물, 100μg/mL 프리모신 및 10μM 신선한 Y-27632로 보충된 유방 상피 세포 성장 배지로 구성됩니다.
2. 방광을 다듬고 소화하는 것
   1. 방광을 옮기고 다시 2 mL의 멸균 DPBS로 생물 안전 캐비닛의 35mm 접시에 씻으십시오.
   2. 네 마리의 생쥐로부터 방광 조직을 1mL의 CCM(-)이 있는 접시에 모으고 수술용 블레이드를 사용하여 각 방광을 네 개의 동일한 조각으로 다듬습니다. 포셉을 사용하여 방광을 펼쳐 요로텔륨 표면을 매체에 노출시킵니다.
   3. 방광 조각과 배지를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 접시를 2 mL의 CCM(-) 2x로 세척하고 원심분리 튜브에서 총 부피 5 mL로 수집한다.
   4. 콜라게나제/히알루로니다아제 혼합물을 최종 농도 300 U/mL 콜라게나제 및 100 U/mL 히알루로니다아제에 첨가하고, 튜브를 37°C 오비탈 인큐베이팅 진탕기에 수평으로 놓고 200 rpm에서 30분 동안 진탕기에서 30분 동안 보관한다.
   5. 조직 소화 후, DPBS에 10% 숯이 벗겨진 FBS의 동량(5 mL)을 튜브에 첨가하고, 튜브를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
   6. 상층액을 제거하고 버립니다. 트립신 대체물 2 mL를 세포 펠릿에 넣고 잘 섞는다. 튜브를 4분 동안 37°C 및 5%_CO2 에서 세포 인큐베이터에 넣었다.
   7. 인큐베이션 후, 표준 P1000 팁으로 10x 위아래로 피펫을 켭니다. DPBS에 10% 숯을 제거한 FBS 5mL를 첨가합니다.
   8. 분리된 세포를 100 μm 멸균 세포 스트레이너를 통해 변형시킨다. 세포 현탁액을 수집하고 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
3. 셀 계수 및 재현탁
   1. 상층액을 제거하고 버립니다. 세포 펠릿을 1 mL의 CCM으로 재현탁시킨다.
   2. 혈구세포계를 사용하여 세포 수를 계수하고, 단지 0.5 x 10⁶ 세포를 0.5 mL의 신선한 CCM이 있는 24-웰 플레이트의 웰에 넣는다. 이때, 엥겔브레스-홀름-스웜 마우스 육종 세포의 매트릭스 추출물( 물질표 참조)을 꺼내어 -20°C에서 보관하고 얼음 위에서 해동시킨다. 6-웰 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에서 예열한다.
      참고: 나머지 세포는 원심분리 및 비바이러스 형질도입 조절을 위한 세포 펠릿으로서 동결될 수 있다.

3. 아데노바이러스 전달 및 도금 오가노이드

주의: 아데노바이러스를 처리할 때는 주의하시기 바랍니다. 실험실 직원은 생물 안전 수준 2 관행을 따르고 아데노 바이러스를 10 % 표백제로 소독해야합니다.

1. 2μL의 아데노바이러스(Ad5CMVCre; 1 x 10⁷ PFU/μL)를 24웰 플레이트에 넣습니다. 분리되지 않은 비뇨 생식기 세포와 잘 섞으십시오.
2. 형질도입 효능을 향상시키려면, 24-웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 스핀오케이션을 수행한다. 24-웰 플레이트를 1시간 동안 37°C 및 5%_CO2 의 세포 인큐베이터에 놓는다.
3. 세포 및 배지를 웰로부터 15 mL 튜브로 옮기고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 버리고, 50 μL의 CCM을 추가하고, 하단의 세포와 잘 섞는다.
4. 140 μL의 매트릭스 추출물을 첨가하고 기포를 피하기 위해 부드럽게 잘 섞으십시오. 용액을 50μL/돔에서 미리 예열된 6웰 플레이트에 빠르게 넣어 오가노이드용 돔을 만듭니다.
5. 플레이트를 5%_CO2 가 있는 37°C 인큐베이터로 부드럽게 옮기고 돔이 5분 동안 응고되도록 한다. 6웰 플레이트를 거꾸로 뒤집고 추가 25분 동안 응고를 계속합니다.
6. 배양 후, 2.5 mL의 CCM을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오가노이드 배양을 위한 인큐베이터에 놓는다.

4. 오가노이드 배양 및 패시징

1. 3-4 일마다 배지를 교체하십시오. Lee et ^al.9에 보고된 바와 같이 오가노이드 배양, 통과 및 동결을 수행한다. Fujii et ^al.10에 기재된 바와 같이 시편 처리 겔을 사용하여 오가노이드의 임베딩을 수행한다.
2. 배지를 제거하고 각 웰에 디스파제 1mL를 첨가한다. 부드럽게 돔을 부수고 P1000 피펫 팁과 잘 섞으십시오.
3. 플레이트를 30분 동안 5%_CO2 가 있는 37°C 인큐베이터에 놓는다. 이어서, 모든 세포를 15 mL 원심분리 튜브에 수집하고, DPBS 중의 10% 숯-벗겨진 FBS 4 mL로 웰을 세척하였다. 오가노이드 세포가 큰 군집으로 나타나면 2.2.6단계를 수행하십시오. 및 2.2.7 단계. 연결이 끊어진 세포를 얻습니다.
4. 튜브를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 1 mL의 CCM으로 세척한다.
5. 세포를 70% 매트릭스 추출물에 재현탁시키고 단계 3.4.-3.6을 따른다. 배양을 위해. 대안적으로, 90% 숯 벗겨진 FBS 및 10 μM 신선한 Y-27632로 보충된 10% DMSO에서 재현탁함으로써 세포를 동결보존한다.

5. C57BL/6J 마우스에 피하 이식 오가노이드 세포

1. 이식 준비
   1. 바늘에 25G 1.5, 1 mL 주사기, 1 mg/mL 디스파제, 매트릭스 추출물, 10 μM 신선한 Y-27632 및 15 mL 원심분리 튜브로 DPBS에 10% 숯을 벗긴 FBS를 준비하십시오.
2. 오가노이드 세포 수집
   1. 적어도 5 계대 동안 안정한 배양을 달성한 후, 생체내 주사를 위해 확장된 오가노이드 세포를 수집한다. 단계 4.2.-4.4를 따르십시오. 세포를 1 mL의 CCM에 재현탁시킨다.
3. 세포 계수 및 피하 주사
   1. 혈구세포계를 사용하여 세포 수를 계산하십시오. 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 2 x 10⁶ 세포를 DPBS의 50% 매트릭스 추출물 100 μL에 재현탁시켰다. 서스펜션을 얼음 위에 놓고 동물 시술실의 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오.
   2. 2마리의 수컷 C57BL/6J 마우스(10주령)를 4% 이소플루란과 1L/min_O2 흐름으로 챔버 내에서 약 4분 동안 마취시킨다. 마우스가 오른쪽 반사를 잃고 호흡 패턴이 더 깊고 느려지면 마우스를 2 % 이소플루란과 1 L /_{min O2} 흐름으로 비 재호흡 회로로 옮깁니다. 외상성 부상으로부터 동물의 눈을 보호하기 위해 수의사 연고를 바르십시오.
   3. 마우스의 오른쪽 옆구리에서 주사 부위 주변의 한 영역을 면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 클렌징 한 다음 25G 바늘을 사용하여 마취하에 오른쪽 측면에 100 μL 세포 현탁액을 직접 주입하십시오.
   4. 주사 후, 흡입 마취를 제거하고 마우스를 열 램프 아래의 케이지에 넣고 완전히 동원 할 때까지 가열합니다. 마우스를 하우징으로 돌려 보내고 종양 형성을 모니터링하십시오.

6. 종양 수집 및 생체내 전파

1. 준비 단계 2.1.1을 따르십시오. 마우스를_CO2 질식에 의해 2.0 L/min 유속을 사용하여 안락사시킨 다음, ~2.0 cm 직경의 종양(거의 2-3주)이 형성된 후 자궁경부 탈구가 뒤따른다. 마우스를 깨끗한 해부 영역으로 옮기고 마우스 옆구리 종양 부위에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 해부 가위와 포셉을 사용하여 종양을 분리하기 위해 절개를하십시오.
2. 종양을 DPBS 5mL로 60mm 접시에 씻고 가위를 사용하여 결합 조직을 제거하십시오. 신선한 종양의 한 조각을 자르고 48 시간 동안 DPBS에 4 % 파라포름 알데히드로 가라 앉히고 조직학 분석을 위해 파라핀 임베딩 및 절편을 위해 보냅니다.
3. 세포 분리를 위해 신선한 종양의 나머지 절반을 처리한다. 간단히 말해서, 신선한 종양을 1mm³ 조각으로 다듬어 5 mL의 CCM(-)이 있는 60 mm 접시에서 해리시킨다. 이어서, 단계 2.2.4.-2.2.8.에 이어서, 분리된 세포를 새로운 C57BL/6J 마우스에 주입하여 단계 5.3 에 이어 생체내 패시징한다. 또는 단계 3.4.-3.6. 에 따라 시험관내 오가노이드 배양물로서 유지하거나, 10 μM 신선한 Y-27632로 90% 숯 벗겨진 FBS 및 10% DMSO를 사용하여 액체 질소에서 직접 동결시킨다.
4. 필요한 경우, 동결된 세포를 37°C 수조에서 빠르게 해동하고 CCM(-)으로 세척하여 회수한다. 그 후, 이를 DPBS의 50% 매트릭스 추출물 100 μL에 재현탁시켜 생체내 종양 형성을 위해 마우스에 직접 주사한다. 하나 생체내 주사를 위해 적어도 2 x 10⁶ 해동된 세포를 사용한다.

마우스 비뇨생식기 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 워크플로우를 도 1A에 나타내었다. 수반되는 비디오는 비뇨생식기 세포가 방광의 안저로부터 어떻게 분리되는지, 그리고 삼중 플록싱된 세포가 Ad5CMVCre로 생체외 에서 어떻게 형질도입되는지를 보여준다. 도 1A는 효소 소화 후 최소 점막하 및 근육 세포가 분리되었음을 보여주었다. 아데노바이러스-Cre 전달의 효율을 확인하기 위해, 막 표적화된 tdTomato/막 국소화된 강화된 녹색 형광 단백질(mT/mG)을 갖는 삼중 플록스 마우스로부터의 분리된 비뇨생식기 세포를 아데노바이러스 Cre로 형질도입하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 거의 100%의 세포에서 검출되었으며, 이는 아데노바이러스 형질도입의 높은 효율을 나타낸다(도 1B).

안정한 TKO 오가노이드는 표준 오가노이드 프로토콜에 따라 확립되었다 (5개 이상의 계대가 있는 시험관내 ; 도 2A). 시험관내 오가노이드 절편의 H&E 및 면역형광(IF)(도 2A)은 비뇨생식기 계통 마커 CK5 및 p6311의 양성 발현을 갖는 고급 비뇨생식기 암종의 형태를 입증하였다. PCR 분석 결과 TKO 오가노이드에서 재결합 대립유전자가 밝혀진 반면, 재결합되지 않은 플록스 대립유전자는 아데노바이러스로 처리되지 않은 비뇨생식기 세포에서만 검출되었다(도 2B). 총 2 x 106 일차 생체외 오가노이드를 8주 내에 초기 피하 (SQ) 종양 형성을 위해 C57BL/6J에 주사하였다. 이어서, SQ 종양 (계대 1)을 수집하고, 마우스에서 계대시켰다. 일반적으로, 2 cm SQ 종양 (계대 2-5)을 형성하기 위해 2-3 주가 필요했다 (도 2C). 생체내 이종이식편 TKO의 면역조직화학(IHC)은 CK7(patchy), CK5, 및 p63의 양성 발현과 CK8 및 우로플라킨 3의 음성 발현을 나타내었다(도 2D). 중간엽 세포의 오염을 검출하기 위해, TKO 종양을 비멘틴에 대해 염색하였다. H & E 염색은 왼쪽에 종양을 보여 주었고 오른쪽의 캡슐은 노란색 선으로 구분되었습니다. 양성 비멘틴은 종양 캡슐 또는 스트로마에서만 검출되었다(도 2E).

도 1: 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실은 loxP 부위를 갖는 마우스 비뇨생식기 세포에서 결실. (A) 생체외 아데노바이러스 Ad5CMVCre를 통한 TKO 오가노이드 생성의 워크플로우. 짧은 시간 30분 효소 소화는 기저 점막하 및 근육 프로프리아로부터 비뇨생식기 세포를 분리시키기에 충분했다. 분리된 비뇨생식기 세포를 TKO 오가노이드에 대해 Ad5CMVCre로 형질도입하고, 이어서 C57BL/6J 마우스에 주사하였다. (B) mT/mG(Cre 재조합 후 녹색 형광 단백질로 전환되는 적색 형광 단백질의 구성적 전이유전자 발현)를 갖는 삼중 플록싱된 비뇨생식기 세포를 Ad5CMVCre로 형질도입하였다. 세포의 거의 100%가 GFP 양성이었으며, 이는 매우 효율적인 형질도입 및 Cre 재조합을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 생체외 아데노바이러스-Cre 재조합효소를 통한 TKO 오가노이드의 특성화. (A) 단절된 Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f 비뇨생식기 세포를 아데노바이러스(Ad5CMVCre)로 형질도입하여 TKO 오가노이드(밝은 장)를 생성하였다. TKO 오가노이드를 시편 처리 겔로 포매하고 H&E 및 면역형광에 대해 염색하였다. (b) 게놈 DNA를 삼중 플록싱된 비뇨생식기 세포(레인 2) 및 TKO 오가노이드(레인 4)로부터 추출하고, PCR에 의해 증폭시켜 Trp53, Rb1, 및 Pten의 플록스된 대립유전자 또는 Cre 재조합된 대립유전자를 검출한다. PCR 밴드는 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 레인 1 및 레인 3은 음성 및 양성 재결합 대조군이었다. (c) 총체적 TKO SQ 종양 (계대 4)을 SQ 주사 후 17일째에 나타내었다. (d) TKO SQ 이종이식편으로부터의 종양 조직 절편을 H&E, IF (CK5, CK8) 또는 IHC (CK7, p63, Upk3)로 염색하였다. 약어: CK5 = 시토케라틴 5; CK20 = 시토케라틴 20; CK8 = 시토케라틴 8; CK7 = 시토케라틴 7; Upk3 = 우로플라킨 III. (e) TKO SQ 이종이식편으로부터의 종양 조직 절편을 H&E 및 IF(vimentin)로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.