간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

교모세포종(glioblastoma)은 임상적으로 이용 가능한 치료법에 의해 완만하게 연장되는 짧은 생존 기간¹이 특징인 파괴적인 질병입니다 ^2,3. 효과적인 치료에 대한 이러한 장애는 주로 절제에 접근하기 어렵고 재발성 종양을 종파할 수 없는 화학저항성 신경교종 줄기세포(GSC)의 고도의 침윤성 특성에 의해 주도된다⁴. 동시에, GSC는 매우 가소성이며, 생존하고 침범하기 위해 종양 미세환경(TME)의 다양한 자극에 반응합니다 ^5,6. 특히, 밀집된 종양과 누출된 혈관 구조는 종양 경계에서 가파른 압력 차이를 생성하여 GSC 침범과 상관관계가 있는 별개의 영역에서 간질액 흐름(interstitial fluid flow, IFF)을 증가시킨다⁷. 이 증가된 IFF는 ^8,9,10에 영향을 미치고, 종종 약리학적 억제에 순응할 수 있는 분자 경로를 통해 ^8,9 GSC 침습을 강화합니다. 그러나 이 과정은 TME의 신경교세포가 신경교종 침습에 미치는 영향으로 인해 혼란스러워집니다. 실제로, 신경교세포는 수많은 상황에서 신경교종 침습을 조절하는 것으로 설명되었으며¹¹, 우리 연구실의 예비 증거에 따르면 신경교세포가 IFF-강화 신경교종 침범에 유사한 영향을 미친다는 것이^{밝혀졌다 12}. 따라서 우리 연구실에서는 IFF 및 glia-GSC 상호 작용을 모두 통합하여 이러한 침습성 종양 경계 영역을 복제하는 조정 가능한 3D TME 모델을 개발하여 IFF 및 glia-GSC 상호 작용을 모두 통합하여 IFF 및 IFF 및 / 또는 후보 치료제의 영향을받는 기타 결과 (즉, 표면 또는 세포 내 단백질 발현, RNA 발현 등)를 정량화했습니다¹² (그림 1).

TME 모델은 널리 발표된 다른 조직 배양 삽입 기반 간질성 유체 흐름 분석(즉, 정적/흐름 분석)과 유사합니다(8,9,10,13,14,15,16,17,18). 이 모델의 주요 차이점은 비독점적이고 조정 가능한 콜라겐-히알루론산 매트릭스의 통합, 환자 TMEs¹²를 대표하는 비율로 성상교세포와 미세아교세포를 매트릭스에 포함시키며, 시스템이 외부 튜브, 저장소 또는 펌프가 없는 웰 플레이트로 완전히 둘러싸여 있다는 것입니다. 히알루론산은 뇌의 세포외 기질(¹⁹)의 주요 구성 요소 중 하나이지만, 유체 흐름을 허용하기에 충분하지 않습니다. 따라서, 콜라겐 I이 혼합물에 포함된다. 가교결합은 두 단계로 발생한다: 자외선(UV)에 노출되면 활성산소가 광개시제로부터 생성되어 메타크릴화 히알루론산 분자(20) 사이에 화학적 가교결합을 생성하는 유리-라디칼-개시 사슬 성장 중합, 그리고 산 보존 콜라겐의 중화 및 열에 노출되어 콜라겐 섬유(^21,22,23)를 형성한다.

이 분석에 최적화된 다양한 파라미터는 이전에 발표된 연구에서 티올 변형 히알루론산-콜라겐 하이드로겔 ^8,12에 설명되어 있습니다. 구체적으로, 이 분석에 사용된 세포(1차 인간 GSC²⁴, 1차 인간 대뇌 피질 성상세포 및 불멸화된 인간 미세아교세포)는 GSC 성장 인자, 0.5% v/v N-2 및 비타민 A¹²가 없는 1% v/v B-27이 보충된 astrobasal media로 구성된 겔에서 3일 동안 최소 60% 생존 가능합니다. 겔을 분해해야 하는 경우(예: 단백질 추출 또는 유세포 분석을 위해) 콜라겐분해효소와 디스파아제가 사용되며 충분한 생존력을 유지합니다(그림 2).

침습을 정량화하려면 GSC가 매트릭스에서 신경교세포와 결합하기 전에 형광 라벨링해야 합니다. 이는 Hoechst 33342(이하에서 설명됨), 세포 추적자(¹²), 유전자 변형, 또는 형질도입(transduction)으로 표지함으로써 달성될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 새로운 마커로 표지된 세포의 생존력은 TME 모델에 통합하기 전에 측정해야 합니다. 또는, 침습이 정량화되지 않지만 단백질 추출, RNA 추출 또는 기타 결과를 위해 겔을 수확하는 경우, 겔 준비 공정 중에 세포를 형광 표지할 필요가 없는 경우가 많습니다. 이 경우, 겔은 이미징을 위해 포르말린으로 고정되거나, RNA 추출을 위해 분해 및 세포를 용해하거나, 유세포 분석을 위해 프로테아제를 사용하여 분해된 후 웨스턴 블롯 또는 기타 단백질 작업을 위해 단백질 용해 완충액으로 용해할 수 있습니다.

여기에서는 인간 성상교세포, 미세아교세포 및 환자 유래 GSC를 환자 정의 비율(4:1:1¹²)로 정적 흐름 조건에서 1.2mg/mL 콜라겐 I, 4mg/mL 히알루론산 매트릭스에 통합하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 분석에 사용되는 특정 매개변수(즉, 세포 비율, 강성, 세포 유형 등)는 생존력이 적절한 경우 다양한 상황을 나타내도록 변경할 수 있습니다.

그림 1: 유체 압력 헤드 아래의 하이드로겔에서 GSC, 성상세포 및 미세아교세포로 구성된 TME 모델의 다이어그램. 세포는 조직 배양 삽입물 내부의 콜라겐-히알루론산 하이드로겔에 내장되어 있습니다. 중력은 그물을 아래쪽으로 밀어냅니다. 조직 배양 삽입 멤브레인의 공극은 아래쪽으로 침입하는 세포가 조직 배양 삽입체의 바닥 표면에 부착할 수 있도록 하며, 이러한 세포를 고정, 이미징 및 정량화할 수 있습니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 하이드로겔 분해 후 세포 생존력. G34s(GSCs), 성상세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)를 4:1:1의 TME 모델에 파종하고 37°C에서 21시간 동안 배양했습니다. 겔을 제거하고 0.3mg/mL 콜라겐분해효소 + 0.02mg/mL 디스파제를 사용하여 총 30분, 45분 또는 60분 동안 피펫팅하여 15분마다(30분 조건) 또는 30분마다(45분 및 60분 조건) 혼합했습니다. 겔을 분해한 후, 세포를 acridine orange(모든 세포) 및 propidium iodide(죽은 세포)로 염색하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계수했습니다. 생존력은 TME 모델 내의 모든 세포에 대해 보고됩니다. 세포는 30-60분 동안 최소 70%의 생존력을 유지했습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. n = 3 개의 생물학적 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 Virginia Tech Institutional Biosafety Committee에서 정한 지침에 따라 개발되었습니다.

참고: 달리 명시되지 않는 한 BSL-2 세포 배양 캐비닛에서 모든 절차를 수행하십시오. 인간 세포 사용에 대한 지침은 해당 기관의 생물 안전 위원회에 문의하십시오.

1. 겔 준비를 위한 계산

1. 실험에 필요한 조건의 수를 계산합니다.
   참고: "조건"은 용액의 내용물(예: 세포 농도, 콜라겐 농도 등)에 의해 정의되며, 이 예에서 사용된 유체 압력 수두와 같이 외부에서 적용되는 변수가 아닙니다.
2. 각 상태 용액에 필요한 겔의 총 부피를 계산합니다.
   참고: 12mm 직경의 조직 배양 인서트를 사용하는 12웰 겔에 필요한 부피는 인서트당 100-150μL입니다. 침입을 정량화할 때 최소 세 가지 기술적 반복이 권장됩니다. 또한 파이펫팅 오류로 인한 부피 손실을 설명하기 위해 각 조건 솔루션에 추가 반복실험의 부피를 추가합니다.
3. 1.2단계에서 실험에 필요한 겔 용액의 총 부피를 계산합니다.
4. 실험에 필요한 3mg/mL 콜라겐 용액의 총 부피를 계산합니다. 파이펫팅 시 부피 손실을 설명하기 위해 이 부피에 최소 10%를 추가하십시오.
   총 부피 3 mg/mL 콜라겐 = 0.4 × 겔 용액의 총 부피
5. 주어진 최종 농도_(cf)에서 3mg/mL 콜라겐 용액의 각 성분에 대한 고농도 쥐 꼬리 콜라겐 I, 멸균 1N NaOH, 멸균 10x PBS 및 멸균수의 부피를 계산합니다: 콜라겐 I c_f = 3mg/mL, NaOH c_f = 콜라겐 I 부피의 2.3% v/v 및 PBS c_f = 1x. 용액을 멸균 초순수(18.2MΩ·cm) 물에 희석합니다.
6. 주어진 최종 농도_(cf)에서 각 조건 용액에 대해 3mg/mL 콜라겐 용액, 1% w/v 메타크릴레이트 히알루론산 및 광개시제, 17mg/mL 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 및 세포 배양 배지의 부피를 계산합니다. 콜라_{겐 f =} 1.2mg/mL, 히알루론_{산 cf =} 0.4% w/v, LAP c_f = 히알루론산 부피의 2% v/v. 세포가 포함된 세포 배양 배지에 용액을 희석합니다.
7. 원하는 비율로 각 조건 용액에 대한 세포 수를 계산합니다(예: 4:1:1 비율로 100uL 하이드로겔당 100,000 GSCs, GSCs:astrocytes:microglia).

2. 재료 준비

1. 실험 전 주에 GSC, 성상교세포 및 미세아교세포를 플레이트링합니다.
   참고: 시술 중 세포의 통과와 손실을 모두 설명하기 위해 겔에 필요한 것보다 약 두 배의 세포 수를 생성하는 플레이트.
2. 멸균 1x PBS에서 17mg/mL의 광개시제 LAP의 작업 용액을 준비합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
3. 제조업체의 지침에 따라 메타크릴레이트 히알루론산을 1x PBS로 재구성합니다. 뚜껑을 닫고 서스펜션을 1시간 동안 또는 4°C에서 녹을 때까지 부드럽게 흔듭니다.
   참고: 이 프로토콜에 사용된 메타크릴레이트 히알루론산은 제조업체에서 지정한 대로 4°C에서 약 1개월 동안 안정적입니다. 빛으로부터 보호하십시오.
4. 겔 표면에서 50mW/^cm2 의 강도로 385nm의 공칭 파장을 가진 시준된 발광 다이오드(LED)를 사용하여 UV 램프를 설정합니다. 세포 배양 캐비닛에 램프를 놓습니다.
   주의: 자외선은 눈을 손상시킬 수 있습니다. 보호 안경을 착용하고 램프를 직접 들여다보지 마십시오.
   참고: 노출 기간(45초) 동안 50mW/cm² 에서 385nm의 빛 노출에 의해 측정되는 생존 가능성 또는 기능적 결과가 큰 영향을 받지 않는지 확인하기 위해 별도의 실험을 수행하십시오.
5. 실험을 위한 매체(astrobasal 매체 + 0.5% v/v N-2 + 비타민 A 없는 1% v/v B-27)를 준비합니다.
   알림: 매체 구성 요소를 결합하고 0.22μm 기공 진공 시스템을 통해 필터링하여 멸균을 보장합니다. 분해를 방지하기 위해 성장 인자(N-2 및 B-27)의 동결-해동 주기를 피하십시오.
6. 스플래시 가드가 제자리에 있는 흄 후드에 1N NaOH를 준비합니다.
   주의: 1N NaOH는 부식성이 높습니다. 주의해서 다루고, 보안경을 착용하거나, 스플래시 가드를 사용하고, 용액을 흄 후드 아래에 보관하십시오.
7. 멸균 초순수(18.2MΩ·cm) 물을 준비합니다.

3. 세포 통과 및 GSC 라벨링

1. 통로 성상교세포, 미세아교세포 및 GSC는 제조업체의 지침에 따릅니다.
2. 제조업체의 권장 사항에 따라 GSC에 Hoechst 33342로 라벨을 붙입니다.
   주의: Hoescht 33342는 눈에 심각한 자극을 유발할 수 있으며 DNA 손상을 유발할 수 있습니다. 조심히 다루세요.
3. 모든 세포를 200 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 부드럽게 버리고 피펫으로 여분의 매체를 제거합니다.
5. 1x PBS에서 GSC를 다시 일시 중단합니다.
6. GSC를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
7. 실험을 위해 배지(astrobasal 매체 + 0.5% N-2 v/v + 1% v/v B-27)의 모든 세포를 재현탁시킵니다.
8. 모든 셀을 세십시오.
9. 각 상태 용액에 필요한 세포의 절대 개수를 상태 용액당 하나의 바이알에 추가합니다. 사용할 때까지 37 ° C, 5 % CO₂ 에 두십시오.

4. 하이드로겔 준비

알림: 메타크릴레이티드 히알루론산과 광개시제를 개봉한 후 겔이 광가교될 때까지 어두운 곳에서 단계를 수행하십시오.

1. 8-11mg/mL(고농도) 콜라겐, 1N NaOH, 멸균 초순수(18.2MΩ·cm) 물, 멸균 10x PBS, 미세 원심분리기 튜브(3mg/mL 콜라겐 용액용), 메타크릴레이트 히알루론산 및 광개시제를 얼음 위에 놓습니다.
   알림: 콜라겐 용액과 접촉하는 모든 물질은 조기 가교를 방지하기 위해 얼음 위에 보관해야 합니다.
2. 조직 배양 삽입물을 플레이트에 넣고 플레이트에 라벨을 붙입니다.
3. 계산된 값을 사용하여 고농도 콜라겐, 1N NaOH, 초순수(18.2MΩ·cm) 물 및 10x PBS를 결합하여 3mg/mL 콜라겐 용액을 준비합니다. 구성 요소를 한 방울 아래로 추가하고 혼합할 때 피펫 팁을 물에 담가 두어 기포 형성을 방지하십시오.
   알림: 기포가 형성되면 원심분리를 하거나 단단한 표면에 튜브를 두드리면 기포가 제거되는 경우가 많습니다. 또한 페놀 레드를 함유한 매체는 pH가 너무 산성이면 노란색으로 변합니다. 이 경우 더 많은 NaOH를 추가해야 합니다.
4. RT에서 5분 동안 200 x g 에서 셀을 원심분리합니다.
5. 각 세포 상태 용액의 상단에서 여분의 미디어를 부드럽게 제거하고 상태에 필요한 미디어의 부피를 남겨 둡니다. 이 용액을 얼음 위에 놓으십시오.
   알림: 세포 손실을 방지하기 위해 이 바이알에서 세포를 옮기지 마십시오. 대신, 모든 겔 상태 성분을 이 바이알에 추가한 다음 부드럽게 혼합하고 겔을 플레이트에 분배합니다.
6. 최종 농도 1.2mg/mL를 위해 계산된 부피 3mg/mL 콜라겐 용액을 4.5단계에서 각 세포 상태 용액에 추가합니다.
7. 최종 농도 0.4% w/v에 대해 계산된 부피 0.4% w/v를 4.5단계의 각 세포 상태 용액에 추가합니다.
8. 4.5단계에서 계산된 17mg/mL LAP 부피를 각 세포 상태 용액에 추가합니다.
   참고: 생존력을 최대화하기 위해 플레이트에 젤을 분배하기 직전에 이 용액을 추가하십시오. 액체 형태의 LAP는 세포 독성이 있습니다.
9. 한 번에 하나씩 각 컨디션 튜브를 혼합하고 각 조직 배양 삽입물에 100-150 μL를 추가합니다. 기포가 형성되지 않도록 피펫 팁을 물에 담그십시오.
10. 385nm UV 램프(50mW/cm²로 설정)를 정전류로 켭니다.
11. 각 젤을 한 번에 하나씩 사진 가교 결합, 각 웰을 각각 45초 동안 UV 광선에 노출시킵니다.
12. 플레이트를 37-45분 동안 37°C에 두어 콜라겐을 가교합니다.
13. astrobasal + 0.5% N-2 v/v + 1% v/v B-27을 사용하여 유체 압력 헤드를 겔에 적용합니다.
    1. Net Zero Flow (static): 웰 플레이트에 700 μL의 배지를 추가하고 조직 배양 삽입물에 100 μL를 추가합니다.
    2. 순 흐름: 웰 플레이트에 100μL의 배지를 추가하고 조직 배양 삽입물에 700μL를 추가합니다.
       참고: 모세관 작용을 사용하여 조직 배양 삽입물 아래에 100μL를 추가합니다. 이 볼륨은 웰 플레이트를 채우지 않습니다.
14. 플레이트를 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 최소 18 시간 또는 최대 5 일 동안 놓습니다.
    참고: 시스템은 분석의 필요에 따라 최대 5일 동안 배양할 수 있지만 초기 침습, 생존 가능성 또는 증식 실험에는 18-24시간의 시간이 충분합니다.

5. 침입 분석을 위한 세포 고정

알림: 조직 배양 삽입 멤브레인이 건조되지 않도록 하고 멤브레인에서 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 용액을 멤브레인에 직접 적용하지 마십시오.

1. 조직 배양 삽입물 및 웰 플레이트에서 배지를 흡입합니다.
2. 조직 배양 인서트에서 겔을 P1000 팁으로 흡입합니다.
   참고: 이 단계에서 겔을 웰에 그대로 두고 5.4단계 참고의 대체 고정 프로토콜에 따라 겔을 이미징을 위해 보관할 수 있습니다.
3. 각 조직 배양 삽입 멤브레인이 덮이도록 1x PBS로 웰 플레이트를 잘 부드럽게 세척합니다.
4. PBS의 4% v/v 포르말린을 웰 플레이트에 추가하여 각 조직 배양 삽입 멤브레인이 덮이도록 하고 RT에서 15-20분 동안 배양합니다.
   주의: 포르말린은 발암 의심 물질이며 심각한 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 스플래시 가드가 있는 흄 후드에 포르말린을 사용하십시오.
   참고: 이 배양 길이는 조직 배양 삽입 멤브레인에만 세포를 고정합니다. 이미징을 위해 겔을 보관하는 경우 4°C에서 1시간 동안 겔을 고정하고 부드럽게 흔든 다음 겔이 침투할 수 있도록 조직 배양 삽입물에 충분한 포르말린을 추가합니다. 고정 후 PBS로 젤을 최소 20분 동안 철저히 세척하십시오.
5. 1x PBS로 각각을 잘 씻으십시오. 그런 다음 각 웰 플레이트 웰 및 조직 배양 삽입물에 1x PBS를 추가로 추가합니다.
6. 면봉을 사용하여 각 조직 배양 삽입 멤브레인의 위쪽을 닦아 젤 조각을 제거합니다. 멤브레인이 건조되는 것을 방지하기 위해 닦은 후 손실된 1x PBS를 각 웰에 반환하십시오.
7. 각 우물을 세척하고 조직 배양 삽입물을 1x PBS에 넣습니다.
   참고: 플레이트는 필요한 경우 밀봉하고 4°C에 배치할 수 있지만 형광 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 이미지 멤브레인을 배치해야 합니다.

6. 이미징 및 정량화

1. DAPI 채널에서 각 멤브레인을 이미징합니다. 가능하면 전체 우물의 타일 형광 이미지를 촬영하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 20x에서 웰의 중심과 4개의 영역을 중심점과 교차하는 십자형으로 이미지화합니다.
   참고: 겔 파편을 피하기 위해 웰의 가장자리를 제외하고 관심 영역(ROI)과 겹치지 않도록 하십시오.
2. 각 이미지의 셀 수를 계산합니다.
3. 각 우물에 대해 침입한 시드된 GSC의 백분율을 계산합니다.
   
4. 기술 반복실험에 대한 침입률의 평균과 표준 편차를 계산합니다.

7. 대체 종점: 유세포 분석

참고: 침습을 분석하는 것 외에도 또는 그 대신에, 고정되지 않은 겔이 분해되고 세포가 유세포 분석 또는 기타 종말점 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 세포 생존율(고정 가능한 살아있는/죽은 염색), 증식(Ki67 항체) 및 줄기(CD71 항체)를 분석하는 프로토콜의 예가 제공됩니다. 다른 관심 마커는 염색 효능을 검증한 후 이 프로토콜에서 대체할 수 있습니다. 특히, GSC를 표적으로 하는 다양한 마커가 존재합니다(²⁵에서 검토됨). 이 프로토콜은 4.14단계 이후에 시작됩니다.

1. 하이드로겔을 분해합니다.
   참고: 2배 농도의 콜라겐분해효소 및 디스파아제 용액을 먼저 실험 매체(아스트로바살 + 0.5% v/v N-2 + 비타민 A 없는 1% v/v B-27)로 준비한 다음 동일한 부피의 하이드로겔에 첨가하여 최종 농도 1배에 도달합니다. 세포마다 효소 분해에 대한 반응이 다르기 때문에 세포 생존율과 수율을 확인하는 것이 좋습니다(그림 2). 최종 콜라겐 분해 효소 농도의 범위는 0.2-0.4 mg / mL이어야하며 최종 dispase 농도 범위는 0.01-0.04 mg / mL이어야합니다. 이 예에서는 0.3mg/mL의 콜라겐분해효소와 0.02mg/mL의 디스파아제가 하이드로겔을 분해하는 데 사용됩니다.
   1. 2x 콜라겐분해효소 및 디스파제 용액(겔 분해 매체 용액)을 준비합니다. 실험 배지(astrobasal + 0.5% N-2 v/v + 1% v/v B-27, 비타민 A 제외)를 사용하여 스톡 콜라겐분해효소를 0.6mg/mL로 희석하고 스톡 디스파아제를 0.04mg/mL로 희석합니다.
   2. 조직 배양 삽입물에서 겔을 제거하고 V-바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다.
   3. 하이드로겔당 동일한 부피의 겔 분해 매체 용액을 각 웰에 추가합니다. 예를 들어, 100μL의 겔 분해 매체 용액을 100μL의 하이드로겔에 추가합니다.
   4. 37°C에서 300-500RPM(궤도: 2mm)의 쉐이커에서 15-30분 동안 배양합니다.
      참고: 세포가 효소 분해에 민감한 경우 최소 간격인 15분 배양을 시도하십시오.
   5. 각 하이드로겔을 위아래로 30-50회 피펫팅하여 하이드로겔을 분해합니다.
      참고: 하이드로겔은 완전히 분해되면 쉽게 피펫팅할 수 있습니다. 겔을 쉽게 피펫팅할 수 없는 경우, 겔을 37°C에서 300-500RPM(궤도: 2mm)의 쉐이커에서 15분 동안 더 배양해야 합니다. 그런 다음 각 하이드로겔을 위아래로 30-50회 피펫팅하여 겔을 분해합니다.중요한 것은 분해 하이드로겔의 배양 시간이 1시간을 초과해서는 안 된다는 것입니다. 이로 인해 세포 생존율이 낮아질 수 있습니다.
   6. 플레이트를 625 x g 에서 4 °C에서 1 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버립니다.
      알림: 상층액은 피펫팅하거나 폐기물 트레이 위로 플레이트를 빠르게 뒤집어 제거할 수 있습니다.
   7. 50μL의 1x PBS로 세포를 재현탁시키고 3개의 기술 복제를 하나의 웰에 풀링하여 단일 생물학적 복제를 생성합니다.
   8. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하여 유세포 분석을 계속합니다.
2. 비특정 바인딩을 차단합니다.
   1. 200μL의 1x PBS/well로 셀을 세척하고 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 달리 명시되지 않는 한 얼음에 대해 다음 단계를 모두 수행하십시오.
   2. 200μL의 차단 용액(10% v/v FBS가 있는 1x PBS)으로 세포를 재현탁시키고 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
   3. 200μL의 1x PBS/well로 셀을 세척하고 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
3. 살아있는/죽은 염색으로 세포에 라벨을 붙입니다.
   1. 고정 가능한 살아있는/죽은 근적외선 염색을 사용하여 세포 생존율을 테스트합니다. 살아있는/죽은 얼룩을 1x PBS로 1:1000으로 희석합니다.
   2. 음성 대조를 위해 200μL의 70% 에탄올로 하나의 웰에 세포를 재현탁시킵니다.
   3. 200 μL의 1x PBS로 나머지 웰의 세포를 재현탁시킵니다.
   4. 얼음 위에서 5-10분 동안 플레이트를 배양하고 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
   5. 50μL의 살아있는/죽은 용액을 각 웰에 추가하고 플레이트를 얼음 위에 15분 동안 배양합니다.
   6. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   7. 웰당 200μL의 흐름 완충액(HBSS, 2% w/v BSA)으로 셀을 두 번 세척합니다.
   8. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
4. 관심 세포 마커(CD71 항체)에 대한 표면 면역염색을 수행합니다.
   1. CD71 항체를 유동 완충액(HBSS, 2% w/v BSA)으로 1:50에 희석합니다.
   2. 각 웰에 50μL의 항체 용액을 추가하고 플레이트를 얼음 위에 15분 동안 배양합니다.
   3. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   4. 웰당 200μL의 흐름 완충액(HBSS 2% w/v BSA)으로 세포를 한 번 세척합니다.
   5. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
5. 관심 세포 마커(Ki67 항체)에 대한 세포 내 면역염색을 수행합니다.
   1. Foxp3 전사 인자 염색 완충액 세트를 사용하여 세포를 고정하고 투과시킵니다. 각 웰에 100μL의 Foxp3 고정/투과화 작업 용액을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
   2. 접시를 얼음 위에 또는 어두운 곳에서 30-60분 동안 상온으로 배양합니다.
   3. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   4. 웰당 200μL의 1x 투과화 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.
   5. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   6. RT에서 100분 동안 100μL의 차단 용액(2% v/v FBS가 있는 1x PBS)을 추가합니다.
   7. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   8. Ki67 항체를 차단 용액(1x PBS, 2% v/v FBS)으로 1:25에 희석합니다.
   9. 50 μL의 1:25 Ki67 항체 용액을 각 웰에 추가하고 어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
   10. 플레이트를 625 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   11. 웰당 200μL의 1x 투과화 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.
   12. 200 μL의 플로우 버퍼로 셀을 재현탁합니다.
6. 유세포분석기를 사용하여 시료를 처리합니다. 게이팅 전략의 예는 Cornelison et al. 2022,¹²에 자세히 설명되어 있습니다.

침습(그림 3), 생존력 및 유세포 분석을 통한 Ki67 및 CD71의 발현(그림 4)에 대한 대표 데이터는 티오 변형 히알루론산-콜라겐 하이드로겔12에 대해 이전에 발표된 GSC 라인에 대해 제공됩니다. TME 모델 내에서 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 존재는 세포주에 따라 GSC 침습에 차별적인 영향을 미칩니다(그림 4). 구체적으로, GSC G44 및 G6224 는 성상교세포 및 미세아교세포가 있거나 없는 TME 모델에 파종되었으며 유체 압력 수두(흐름) 또는 순 제로 흐름(정적)에 노출되었습니다.

TME 모델 내에서 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 존재 대 부재는 정적 조건 내에서 G44 침입의 감소와 관련이 있었다(그림 3; p < 0.05). 대조적으로, 흐름이나 성상교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)의 존재는 G62 침습에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 침습에 대한 종양 미세환경 및 흐름의 이러한 상이한 효과는 추가 세포주(12 )에 대해 설명되었으며, 모델 시스템에 통합된 새로운 세포주에 대해 조사되어야 한다.

TME 모델에서 GSC의 생존력, Ki67+ 증식 및 CD71+ 줄기를 분석하기 위해 GSC 라인 G3424에 형광 염료 표지된 성상교세포 및 미세아교세포를 파종하고 정적 또는 흐름을 적용했습니다. 그런 다음, 겔을 분해하여 유세포 분석을 위해 세포를 분리했습니다. 세포를 고정 가능한 살아있는/죽은 세포로 염색한 후, Ki67 또는 CD71 항체12로 고정하고 표지하였다. 그림 4A는 성상교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)와 구별된 생CD71+, Ki67+ G34에 대한 일반적인 게이팅 프로토콜을 보여줍니다. G34 증식(Ki67)은 겔에 단독으로 있을 때(p < 0.001) 및 정적 조건 내에서 신경교세포의 존재 및 부재(p < 0.05)에 비해 유동이 유의하게 증가했습니다(그림 4B). 통계적으로 유의하지는 않지만, G34는 겔에 혼자 있을 때 흐름 중 CD71 발현이 증가하는 경향을 보였습니다. 이러한 경향은 신경교세포(glia)가 있는 경우에는 관찰되지 않았습니다(그림 4C). 이 방법은 TME 모델 내의 각 세포 유형에 대한 다른 관심 마커를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

특히, 신경교종 침범에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 여러 요인(겔 강성, 반응성 신경교증, 선택 및 passaging으로 인한 표현형 변화 등)에 의해 발생하는 변동성으로 인해 효과 크기를 보고하는 것이 도움이 되는 경우가 많으며, 새로운 세포주를 분석하기 전에 생물학적 복제에 대한 기술 복제를 생성하고 전력 분석을 수행해야 합니다. 일반적으로 n = 3-6개의 생물학적 복제가 허용됩니다. 변동성을 최소화하고 전력을 최대화하려면 가능한 경우 서로 다른 GSC 라인 간의 비교를 포함하여 모든 조건을 동일한 실험 내에서 실행해야 합니다.

그림 3: 두 GSC 라인에 걸친 흐름 자극 침입에 대한 종양 미세환경의 차별적 영향. 형광 표지된 GSC(G44 및 G62)를 하이드로겔 단독(-A/M) 또는 성상세포와 미세아교세포(+A/M)와 함께 파종했습니다. 유체 압력 헤드는 "흐름" 조건에 적용되었습니다. 제로 순 유체 흐름이 "정적" 조건에 적용되었습니다. 침습된 GSC를 조직 배양 삽입 멤브레인에 고정하고, 계산하고, 기술적 복제 간에 평균을 구했습니다. 평균 침입은 각 생물학적 복제에 대해 표시되었습니다. G44 침입은 정적 조건 내에서 A/M의 존재에 의해 유의하게 감소되었다(p < 0.05). 대조적으로, 흐름이나 A/M의 존재는 G62의 침공에 영향을 미치지 않았습니다. 침입한 시드된 GSC의 비율은 SEM± 평균으로 표시됩니다. n = 3 개의 생물학적 복제; *p < 0.05는 정합된 2-way ANOVA와 Tukey의 다중 비교에 대해 계산됩니다. 데이터는 Cornelison et al. 202212의 허가를 받아 재포맷 및 재인쇄됩니다. 통계 분석은 관심 세포주만 포함하도록 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: TME 모델 내 GSC의 생존력, 증식(Ki67) 및 줄기(CD71) 측정. GSC는 TME 모델에서 성상교세포(녹색) 및 미세아교세포(짙은 빨간색)로 표시된 형광 염료를 사용하거나 사용하지 않고 파종하고 순 제로 유체 흐름(정적) 또는 순 흐름(흐름)에 노출되었습니다. 겔을 생/사광선 근적외선 염료와 유세포 분석을 위해 Ki67 또는 CD71 항체로 분해하고 염색했습니다. 아이소타입 컨트롤은 회색으로 표시됩니다. (A) 세포 유형을 게이트하고 생존 가능한 세포를 살아있는/죽은 근적외선 염색을 통해 정량화했습니다. (B) G34s의 Ki67 증식은 하이드로겔 내에서만 있을 때(p < 0.001) 정적 상태(p < 0.05) 내에서 성상교세포와 미세아교세포(A/M)가 있을 때 정적에 비해 유동이 유의하게 증가합니다. (C) 대조적으로, 통계적으로 유의하지 않지만, CD71 발현으로 대표되는 G34 줄기는 TME 모델에 성상교세포와 미세아교세포를 포함함으로써 정적 조건에서 유지됩니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. n = 3 개의 생물학적 복제. *이원 분산 분석의 경우 p < 0.05 및 ***p < 0.0001 후 Tukey의 다중 비교가 이어집니다. 이 그림은 Cornelison et al. 2022,12; 패널 B와 C의 정적 조건을 보여주는 추가 데이터가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 관련 이해 상충이 없습니다.