Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

유방암은 전 세계적으로 여성에게 진단되는 주요 유형의 암이며 암으로 인한 주요 사망 원인입니다¹. 유방암의 발병 기전은 유전학, 환경, 생활 방식과 같은 여러 요인이 관련되어 복잡합니다. 활성 우유 생산 세포인 HMEC는 유방 조직의 가장 중요한 구성 요소 중 하나이며 유방암 발암에 관여하는 원래 세포일 가능성이 높습니다. 따라서 HMEC은 유방암 연구에서 연구자들로부터 가장 많은 주목을 받고 있다². 또한, 일차 세포는 유전적 안정성, 정상적인 형태 및 불멸화된 세포주로는 달성할 수 없는 보다 완전한 기본 세포 기능 세트를 유지함으로써 복잡한 세포 과정에 대한 생물학적으로 관련된 특성을 제공할 수 있는 능력을 가지고 있습니다³. 따라서 일차 HMEC의 격리 및 배양은 유방암 및 유방 염증성 질환과 같은 대부분의 유방 관련 질환 연구에 필수적인 단계입니다.

현재 쥐, 소, 돼지 및 염소로부터 유방 상피 세포의 분리, 배양 및 식별을 위한 안정적이고 재현 가능한 시스템이 확립되었습니다 4,5,6,7. 그러나 1차 HMEC의 분리 및 배양은 복잡한 미세환경과 세포의 낮은 수율로 인해 까다롭습니다. 수십 년 동안 과학자들은 HMEC를 분리하고 배양할 수 있는 가장 효과적인 방법을 찾고 있었지만 HMEC를 위한 배양 시스템이 거의 20년 전에 확립되었습니다. 예를 들어, Hammond et al.은 HMEC가 효율적으로 성장하는 무혈청 배양 배지를 개발했습니다⁸. 최근 Zubeldia-Plazaola 등은 HMEC를 얻기 위해 순차 여과 또는 차등 원심분리 단계와 결합된 빠른/느린 효소 분해 절차를 사용하여 4가지 다른 분리 방법을 테스트했습니다⁹. 그들은 차등 원심분리와 함께 느린 소화 방법이 신선한 유방 조직에서 HMEC를 분리하는 가장 효율적인 방법이라는 것을 발견했습니다. 그러나 이 분리 방법은 큰 조직 조각(40-75g)이 필요하고 더 많은 양의 소화 효소를 사용합니다. 그들의 절차는 복잡하고(서로 다른 세포 분획을 얻기 위해 최소 세 가지 다른 원심분리) 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 연구 및 임상 응용을 위해 소량의 유방 조직에서 HMEC의 집단을 효율적으로 얻기 위해서는 여전히 간단하고 빠른 방법이 필요하다⁹.

우리의 이전 연구는 Rho-associated kinase (ROCK) 억제제 Y-27632를 초기 배양 배지에 첨가하면 인간 피부 표피 세포(¹⁰)를 분리하는 과정을 단순화할 수 있음을 보여주었으며, 이는 치은 상피 세포(¹¹)의 분리에도 성공적으로 사용되었습니다. 또한, Zubeldia-Plazaola 연구팀과 Jin 연구팀이 실시한 선행 연구에 따르면 Y-27632는 유방 조직 ^9,12에서 유래한 일차 상피세포의 빠르고 무제한적인 체외 성장을 자극할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 Y-27632를 사용하면 HMEC의 분리 및 배양이 단순화되는지 여부를 테스트하는 것을 목표로 했으며, 유방 조직의 작은 조각(1g)에서 HMEC를 분리하는 간단하고 쉽게 수행할 수 있는 방법을 성공적으로 확립했습니다.

이 프로토콜에 사용된 신선한 정상 유방 조직은 저장성 중문대학교 제1부속병원 의료윤리위원회의 지침에 따라 저장중의과대학 제1부속병원에서 난치성 육아종성 소엽유선염의 병변 주위 수술에서 채취한 것입니다(의정서 번호. ChiMCTR2100005281, 날짜: 2017-07-17).

1. 조직의 획득

1. 성인 여성에서 채취한 수술 표본에서 신선한 유방 조직을 3% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 멸균 튜브에 수집합니다.
   참고: 유방 조직은 수술 후 채취 후 24시간 이내에 다음 세부 사항에 따라 처리해야 합니다.

2. 조직의 전처리

1. 두 쌍의 집게로 유방 조직에서 지방 조직을 제거하고 나머지 유방 조직의 무게가 ~1g이 되도록 합니다.
2. 유방 조직을 75% 에탄올 용액(5mL)에 5초 동안 헹구고 20mL의 세척 용액(표 1)으로 2 x 5분 동안 세척합니다.

3. 조직의 소화

1. 유방 조직을 더 작은 조각으로 자르고 두 개의 수술용 칼날을 사용하여 15분 동안 조직을 파쇄하여 조직 균질화를 얻습니다. 조직 조각을 50mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
2. 유방 조직 조각이 들어있는 50mL 원심분리 튜브에 총 20mL의 분해 용액에 5.0mg/mL 디스파제 + 5.0mg/mL 콜라겐분해 효소 용액 5.0mL, 0.25% 트립신 3mL, PBS 7mL를 추가합니다. 튜브를 37 ° C의 수조에 넣고 1.5 시간 동안 배양하십시오. 20분마다 튜브를 흔듭니다.
3. 중화 용액 20mL를 주입하여 분해 과정을 중지합니다. 피펫팅으로 내용물을 ~15배 섞습니다.
4. 100μm 메쉬 필터를 통해 혼합물을 여과합니다. 156 × g 에서 5분 동안 원심분리기
5. 상층액을 제거하고 20mL의 중화 용액으로 펠릿의 배양을 반복합니다. 피펫팅으로 15배를 섞고 156× g 에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.
6. 상층액을 조심스럽게 제거하고 초기 배양 배지 10mL로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 100mm 세포 배양 접시에 담습니다.
7. 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 원래 배양 배지를 3일마다 새로운 상피 세포 배지로 교체합니다. 셀을 확인하고 2일마다 배지를 새로 고칩니다.

4. 세포 통과

1. 세포가 80%-90% 밀도에 도달하면 인큐베이터에서 100mm 접시를 제거하고 사용한 배지를 버리고 접시를 2mL의 PBS로 2번 헹굽니다. PBS를 제거한 다음 각 100mm 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다.
   알림: 트립신 용액이 접시 바닥에 충분히 닿도록 접시를 휘젓습니다.
2. 분해 과정을 위해 100mm 접시를 37°C 인큐베이터에 ~7분 동안 넣습니다.
3. 40x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 세포를 검사하여 대부분의 세포가 접시 바닥에서 분리되었는지 확인합니다.
4. 8mL의 중화 용액을 추가하여 분해 과정을 중지하고 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 위아래로 10-15x 피펫팅하여 세포를 혼합합니다. 156× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
5. 상층액을 조심스럽게 제거하고 10mL의 상피 세포 배지로 세포를 재현탁시키고 세포 수를 계산합니다.
6. 100mm 접시에 10mL의 상피 세포 배지에 1 × 10⁶ 세포를 추가합니다.
7. 상피 세포 배지를 새로 고치고 2일마다 세포를 관찰합니다.

5. 세포 동결 보존

1. 4.1-4.4단계를 반복합니다.
2. 상층액을 조심스럽게 제거하고 2mL의 세포 동결 보존 용액에 세포를 재현탁시킵니다.
3. 세포가 들어있는 동결 보존 용액 1mL를 각 극저온 바이알에 옮깁니다.
4. 냉동 보존된 세포의 이름, 통로 번호 및 날짜를 기록하십시오.
5. 바이알을 -80 °C의 제어된 속도 냉동 용기에 밤새 넣습니다.
6. -80 °C 냉동고에서 극저온 바이알을 제거하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 빠르게 옮깁니다.

그림 1 은 절차의 개략도를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 효소, 즉 dispase, collagenase 및 trypsin의 조합이 사용됩니다. 이 조합은 그 아래의 섬유아세포층에서 상피 시트를 분리하고 이어서 트립신을 사용하여 유방 상피 세포를 현탁액으로 해리시키는 목적으로 사용됩니다. 또한, 상피 세포의 성장은 초기 배양 배지에 Y-27632를 첨가함으로써 효과적으로 촉진되었습니다. 결과적으로 이 방법은 많은 수의 HMEC를 생성하여 평균 10일 만에 패리시징 요구 사항을 충족합니다.

분리 후 세포 성장에서 Y-27632의 중요한 역할을 테스트하기 위해 갓 분리한 세포를 두 그룹으로 나눴습니다: 한 그룹은 10mM Y-27632를 포함하는 초기 배지로 도말되었습니다(그림 2A). 다른 그룹은 Y-27632를 대조군으로 추가하지 않고 초기 매체로 도말하였다(그림 2B). 2일간의 배양 후, 두 그룹의 세포를 표피 세포 배지로 전환했습니다(그림 1). 그림 2에서 셋째 날과 비교하여 Y-27632를 사용한 방법이 9일째에 HMEC의 수를 눈에 띄게 증가시켰음을 관찰할 수 있습니다. HMEC는 세포들 사이에 뚜렷한 경계와 강한 연결을 가진 섬을 닮은 응집력 있는 그룹을 형성했습니다. 이 세포는 주변 환경으로 바깥쪽으로 확장되었습니다. Y-27632로 도금된 세포(그림 2A)는 대조군의 세포(그림 2B)보다 훨씬 빠르게 성장했습니다. Y-27632가 HMEC 성장을 향상시킨다는 것을 확인하기 위해, 동결된 P0 세포를 10mM Y-27632를 첨가하거나 첨가하지 않고 해동 및 도말하고, 그림 3과 같이 다른 날에 통로 1(P1) 세포를 수집하였다. 세포는 cell count kit-8(CCK-8)을 사용하여 생존율과 증식을 분석했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, Y-27632 함유 배지로 처리된 세포의 성장률은 Y-27632가 없는 대조군의 세포보다 유의하게 높았다. 이러한 데이터를 종합하면 초기 배지에 Y-27632를 추가하면 분리 후 부착된 세포의 성장이 크게 향상됨을 알 수 있습니다.

이 방법으로 얻은 세포가 HMEC인지 확인하기 위해 두 가지 유방 상피 세포 마커인 CK7 및 GATA3에 대해 P0 HMEC의 면역형광 분석을 수행했습니다. 진단학적으로 중요한 사이토케라틴(cytokeratin)인 CK7은 정상 유방 상피의 선 분화(glandular differentiation)와 그 증식성 상피 과정(proliferative epithelial process)의 표지자이다13. 또한, Kouros-Mehr 등은 GATA3가 유방 상피 세포 내에서 전사 인자로 기능하고 완전히 발달된 유선에서 내강 상피 분화를 유지하는 데 관여한다고 보고했습니다14. 그림 3에서 볼 수 있듯이 배양 및 증식한 세포는 CK7(그림 4A)과 GATA3(그림 4B)를 모두 강하게 발현합니다. CK7 및 GATA3 양성 세포의 정량 분석은 세포의 98% 이상이 CK7과 GATA3를 모두 발현하는 것으로 나타났으며(그림 4C), 이는 섬유아세포와 같은 다른 유형의 세포에 대한 오염이 제한적임을 나타냅니다. 초기 배양(P0, 그림 2)에서 제한된 수의 섬유아세포 유사 세포(길쭉한 형태)를 가끔 관찰했지만, 이러한 세포가 통로 세포(P3, 그림 4D)에서 나타나는 경우는 거의 없습니다.

HMEC의 상피 특성이 여러 통과 후에도 유지될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 Y-27632가 있거나 없는 배양된 세포에서 유방 상피 세포 마커 CK7 및 GATA3의 qRT-PCR 분석을 수행했습니다(그림 5). CK7 및 GATA3의 발현 수준은 Y-27632가 있든 없든 P0 및 P3 세포 모두에서 유의하게 다르지 않았으며, 이는 이들의 표현형 및 분화 특성이 배양 확장 중에 시간이 지남에 따라 변하지 않았음을 나타냅니다.

그림 1: HMEC를 격리하고 배양하기 위한 프로토콜의 순서도. 처음에는 여성의 유방 조직 조각을 수술용 칼날로 잘라내고 효소의 조합으로 소화했습니다. 이어서, 수득된 세포 펠릿을 10mM Y-27632를 함유하는 초기 배양 배지에서 배양하였다. 2일 후, 초기 배양 배지를 상피 세포 배지로 교체했습니다. 유방 상피 세포는 표피 세포 배지에서 배양하여 ~8일 후에 만족스러운 커버리지를 달성했으며, 이제 passaging에 적합합니다. 필요한 경우, 일부 세포는 세포 동결 보존을 실시할 수 있습니다. 약어: HMECs = human mammary epithelial cells. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 최초 접종 후 얻은 HMEC의 이미지. 접종 후 2일 이내에 (A) 1차 HMEC는 Y-27632를 함유한 초기 배지에서 배양하였고 (B) 1차 HMEC는 Y-27632가 함유되지 않은 초기 배지에서 배양하였다. 48시간의 배양 기간 후, 혈청이 없는 각질세포 배양 배지를 두 그룹 모두에서 교체했습니다. 세포의 성장 상태를 이틀에 한 번씩 기록하기 위해 사진을 촬영했습니다. 대표적인 이미지 시리즈인 두 시리즈는 접종 후 3일째, 5일째, 9일째에 도립 현미경(100×)을 사용하여 촬영했습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: HMECs = human mammary epithelial cells. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Y-27632를 사용한 Passage 1 HMEC(P1)의 성장 향상. 동결된 P0 세포를 해동하고 Y-27632를 사용하거나 사용하지 않고 배양했습니다. 세포(P1)는 1일, 3일, 5일, 7일, 9일에 수집하고 CCK-8 키트를 사용하여 450nm에서 흡광도를 분석했습니다. 1일째에 Y-27632를 포함하는 초기 배지에서 부착 가능한 생존 세포의 수는 Y-27632가 없는 세포보다 훨씬 높았습니다. 또한, Y-27632로 처리된 세포의 성장 곡선은 더 가파른 증가를 보였다. **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: HMECs = human mammary epithelial cells. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: HMEC 마커(P0)의 발현. HMEC에서 CK7 및 GATA3의 발현은 면역형광 염색으로 분석되었습니다. HMEC는 (A) CK7(적색) 및 (B) GATA3(적색)에 대해 염색되었습니다. DAPI(파란색)를 사용하여 핵을 염색했습니다. 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(400×)을 사용하여 촬영했습니다. 척도 막대 = 20 μm. (C) 염색에서 양성 세포의 비율; (D) HMEC의 대표 이미지(P3). 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: P0 및 P3에서 HMEC의 CK7 및 GATA3 발현. qRT-PCR을 사용하여 7일째에 P0 및 P3의 HMEC에서 (A) CK7의 발현, (B) P0 및 P3의 HMEC에서 GATA3, 7일째에 Y27632 유무에 관계없이 배양된 P1 HMEC의 (C) CK7, 7일째에 Y-27632 유무에 관계없이 배양된 P1 HMEC에서 (D) GATA3의 발현을 검출합니다. NSP > 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자들은 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.