2.8: RT-PCR을 사용한 환경 검체의 RNA 분석

1. 샘플 수집 : 토양 샘플

1. GPS, 좌표 또는 시력을 통해 샘플 위치를 찾습니다.
2. 무작위 샘플링의 경우, 미생물 서식지의 일반적인 인구 조사를 얻기 위해 지역 내에서 임의의 점을 선택합니다. Transect 샘플링은 스트림베드에 인접한 직선과 같은 지점에서 수집합니다. 그리드 샘플은 일정한 간격으로 지점에서 체계적으로 채취되며 알 수 없거나 가변 영역에서 미생물 커뮤니티를 매핑하는 데 유용합니다.
3. 3-6 인치 (7.5-15cm) 깊이 내에서 샘플링하면 뿌리 권부체 (식물 뿌리 및 관련 미생물에 의해 직접 영향을받는 토양의 좁은 영역)에 가깝지만 그 안에있는 가장 풍부한 미생물 활성에 대한 액세스를 제공합니다.
4. 토양 샘플을 수집하려면 손 오거를 땅에 밀어 넣고 미리 정해진 깊이로 비틀어 보냅니다.
5. 오거를 들어 올립니다. 토양은 오거의 중공 줄기 내에서 발견된다.
6. 오거 바닥의 토양을 토양 컬렉션 백으로 긁어 넣습니다. 토양을 만지거나 오염시키지 않도록 하십시오.
7. 가방의 위치, 이름, 날짜 및 시간으로 적절하게 라벨을 지정합니다.
8. 실험실에서 토양을 2mm 체로 통과하여 자갈과 바위를 제거합니다.
9. 토양 수분 함량에 대한 토양의 일부를 분석합니다. 이 단계에 대한 자세한 내용은 토양 수분에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

2. 샘플 수집 : 물 샘플

1. GPS, 좌표 또는 시력을 통해 샘플 위치를 찾습니다.
2. 수납병에 물을 채집합니다. 수집된 물의 양을 기록합니다. 시료내의 미생물이 정량적으로 분석되면, 미생물 농도는 수집된 부피에 기초하여 결정될 수 있다.
3. 적절한 전자 프로브를 사용하여 실험(온도, pH, 전도도, 염도, 질소 및 인 함량 등)에 필요한 모든 매개변수에 대해 즉시 물을 테스트합니다.
4. 물 샘플이 들어 있는 병을 얼음이 있는 쿨러에 넣습니다. 쿨러를 실험실로 옮기십시오.

3. RNA 추출

1. 환경 샘플에서 미생물을 수집하고 농축하려면 지역 사회 핵산 추출에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.
2. 제조업체의 지침에 따라 상용 추출 키트를 사용하여 바이러스에서 RNA를 추출합니다.
3. 먼저 에탄올로 보완된 리시스 버퍼와 샘플을 혼합한 다음 샘플을 스핀 컬럼에 추가합니다.
4. 약 12,000 x g의 컬럼을 원심분리하고 흐름을 폐기합니다. 열과 원심분리기에 버퍼를 다시 추가합니다.
5. RNase 가없는 물을 컬럼과 원심분리기에 30 초 동안 RNA를 멸균 1.5mL 저접착 미세 분리 튜브에 넣습니다.

4. 역 전사 - PCR

1. -20°C 냉동고에서 다음 시약을 검색: dNTP,농축(예를 들어,10x) 역전사 버퍼, 프라이머(이 예에서, 임의의 프라이머). 얼음이나 깨끗한 후드 내부의 실온에서 해동하고, 한 번 해동 얼음에 보관하십시오. 또한 역 전사및 RNase 억제제를 회수하고 얼음에 보관하십시오.
2. 모든 반응 중 모든 시약을 일정하게 결합하는 "마스터 믹스"를 만드는 데 필요한 시약 볼륨을 계산합니다(샘플 반응의 경우 표 1 참조). 모든 샘플에 대한 충분한 마스터 믹스뿐만 아니라 긍정적 인 제어 (알려진 성적 증명서 템플릿 사용) 및 음성 제어(예 :역 전사없이, 템플릿으로만 물) 반응을 준비합니다. 볼륨에 10%를 추가로 포함합니다.
3. 마스터 믹스를 1.5mL 저접착 마이크로퍼지 튜브에 조립합니다. 이것은 관의 플라스틱 벽에 시약 분자의 결합을 최소화합니다.
4. 시약이 해동되면 계산된 볼륨을 미세 분리 튜브에 추가합니다. 부드럽게 소용돌이와 원심 분리기 각 튜브추가 전에. 오염을 방지하기 위해 각 시약을 추가하는 것 사이에 파이펫 팁을 변경해야 합니다.
5. 모든 시약이 추가 된 후, 소용돌이와 원심 분리는 균일 한 혼합물을 보장하기 위해 마스터 믹스를 합니다. 시약을 -20°C에서 다시 저장에 넣습니다.
6. 8튜브 PCR 스트립을 준비하고 라벨을 부착하여 각 샘플 또는 제어 반응에 대해 하나의 튜브를 지정합니다.
7. 알리쿼트 각 튜브에 마스터 믹스의 동일한 볼륨. 이어서, RNA 추출물과 같은 반응 특이적 성분을 추가한다.
8. 스트립 캡을 PCR 스트립에 단단히 놓고, 스트립 튜브 어댑터가 있는 미니센트심분리기에 원심분리기를 배치하여 모든 액체가 각튜브(그림 2)의바닥에 수집되도록 합니다.
9. 온도 사이클러에 PCR 스트립을 안전하게 배치합니다. 튜브가 고정되도록 아래로 누릅니다.
10. 사용 중인 RT에 적합한 프로그램을 실행하도록 열순환기를 설정합니다(샘플 프로토콜의 표 2 참조). 프로그램이 완료되면 튜브에는 cDNA 제품이 포함되어 있으며, 이 제품에는 PCR 증폭이 가능합니다. 자세한 내용은 PCR 및 정량PCR의 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오. 사용 전까지 cDNA를 -20°C에 저장합니다.

그림 2. 마스터 믹스와 추출물을 함유한 8튜브 스트립을 덮었다.

표 1. RT 마스터 믹스 성분.

표 2. RT 반응 열순환기 프로그램.

역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하면 환경에서 RNA 바이러스 및 미생물 유전자 발현을 검출할 수 있습니다.

DNA를 유전 물질로 사용하는 인간에서 박테리아에 이르는 세포 유기체와 달리 일부 바이러스는 독감, 에볼라, HIV와 같은 많은 병원성 바이러스를 포함하여 RNA로 구성된 게놈을 가지고 있습니다. 일부 바이러스는 세포 배양에서 세포를 감염시키는 데 사용될 때 발생하는 병원성 표현형을 관찰하여 검출할 수 있지만, 대다수는 배양 기반 특성화 방법이 없습니다. RT-PCR은 고감도로 환경에서 이러한 바이러스의 존재를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

동시에, DNA 기반 게놈을 가진 유기체는 DNA 게놈에 인코딩된 유전 정보를 메신저 또는 "m" RNA로 "전사"하여 "표현"한 다음 단백질로 "번역"하여 세포에서 효소 또는 구조적 기능을 수행할 수 있습니다. 미생물이 다양한 유전자 경로를 켜거나 꺼서 환경 변화에 반응하고 적응함에 따라 RT-PCR은 잠재적인 생태계 평가자 역할을 하기 위해 유전자 발현의 이러한 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오는 RT-PCR의 원리를 살펴보고, 이 기술을 수행하기 위한 일반화된 절차를 간략하게 설명하고, 마지막으로 이 방법이 오늘날 환경 미생물학에 적용되는 몇 가지 방법을 검토합니다.

이 절차에는 생물학적 샘플에서 RNA를 추출한 다음 DNA로 역전사하는 두 가지 핵심 부분이 있습니다.

RNA의 분리에는 지질과 단백질을 분해하는 세제를 첨가하여 샘플의 세포를 용해한 다음 기계적 파괴가 포함됩니다. 바이러스에서 RNA를 추출하려면 일반적으로 단백질 소화 효소인 단백질 분해 효소인 단백질 분해 효소를 첨가하여 바이러스의 캡시드(capsid, 바이러스 입자를 형성하는 단단한 단백질 코팅)를 분해해야 합니다. 반면에, 세포 유기체에서 RNA를 얻을 때 용해물은 화학적으로 유사한 DNA의 존재로 인해 다운스트림 결과가 혼동되는 것을 방지하기 위해 DNA 분해 효소 또는 DNAase로 처리해야 할 수 있습니다.

그런 다음 RNA는 두 가지 방법 중 하나로 용해물에서 정제할 수 있습니다. 산성 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 추출로 알려진 한 가지 방법에서, 용해물을 유기 수성 혼합물과 혼합한 다음 원심분리하여 상을 분리합니다. 단백질은 유기상(organic phase)으로, 용해된 세포 파편은 흐린 간기(cloudy interphase)로, 핵산은 수성상(aqueous phase)으로 분할됩니다. 그런 다음 상부 수성상을 수집할 수 있으며 RNA는 이소프로판올과 같은 알코올을 첨가하여 침전되어 물에 대한 핵산의 용해도를 감소시킵니다.

컬럼 기반 RNA 분리에서 용해물은 알코올과 혼합된 다음 실리카와 같은 음전하를 띤 수지와 함께 겔 여과 컬럼을 통과합니다. 용해물은 완충액의 양전하를 띤 이온이 핵산의 음전하를 띤 인산염 골격이 수지에 결합할 수 있도록 하는 "염교(salt bridges)"를 형성하도록 준비됩니다. 그런 다음 다른 모든 오염 물질이 씻겨 나갑니다. 핵산은 저염 완충액 또는 물을 사용하여 컬럼에서 "용출"됩니다. single-stranded RNA는 double-stranded DNA보다 음전하가 적기 때문에 특정 농도의 buffer를 사용하여 우선적으로 용리될 수 있습니다.

일단 분리되면 RNA는 화학적으로 더 안정적인 DNA로 변환됩니다. 과학자들은 HIV와 같은 레트로바이러스에 의해 자연적으로 암호화되는 효소를 이용했습니다. 이 효소는 역전사효소 또는 "RT"로 알려져 있습니다.

RT는 프라이머(primer)로 알려진 짧은 뉴클레오티드에서 상보적 또는 "c" DNA를 합성합니다. 이 프라이머는 실험의 목적에 따라 다른 염기서열을 가질 수 있습니다. 예를 들어, 프라이머는 특정 유전자 또는 유기체를 검출하기 위해 특정 염기서열을 갖도록 설계할 수 있습니다. 일단 종합되면, 이 "첫번째 물가" cDNA는 일정한 PCR에 의해 증폭될 수 있습니다.

이제 RT-PCR의 원리를 이해했으므로 환경에서 수집한 RNA 샘플에 대해 이 기술을 수행하기 위한 프로토콜을 살펴보겠습니다.

절차를 시작하려면 GPS 좌표 또는 시력을 사용하여 검체 채취 위치를 찾으십시오. 미생물 서식지에 대한 일반적인 조사를 받기 위해 지역 내의 임의의 지점을 선택하십시오.

고체 샘플을 수집하려면 손 오거를 미리 결정된 깊이까지 땅 토양으로 밀어 비틀십시오. 오거를 들어 올리면 오거의 속이 빈 줄기 내에서 흙을 찾을 수 있습니다.

이 토양은 토양 수집 백에 직접 긁어내고 백에는 위치, 이름, 날짜, 수집 시간 및 기타 필요한 정보가 표시되어 있습니다.

토양을 실험실로 옮기고 토양을 2mm 체에 통과시켜 자갈과 암석을 제거합니다. 토양의 수분 함량에 대한 토양 샘플을 분석하면 토양의 미생물 활동 수준에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 이렇게하려면이 컬렉션의 비디오 "토양의 수분 함량 측정"을 참조하십시오.

물 샘플 채취의 경우 토양 채취와 유사한 관심 사이트를 선택하고 두꺼운 벽의 멸균 플라스틱 병에 물을 모으십시오. 수집된 물의 양을 기록해 두십시오. 온도, pH 및 염도와 같은 매개변수에 대해 물을 즉시 테스트하여 샘플의 예상 미생물 수준에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 그런 다음 병을 쿨러에 넣고 실험실로 옮깁니다.

바이러스와 같은 미생물은 환경 샘플에서 수집되어 농축됩니다.

RNA는 제조사의 지시에 따라 상용 RNA 추출 키트를 사용하여 스핀 컬럼 방법으로 수집된 바이러스에서 추출할 수 있습니다. 에탄올이 보충된 용해 완충액을 먼저 샘플과 혼합합니다. 적절한 수의 스핀 컬럼을 수집 튜브에 배치한 다음 샘플을 컬럼 매트릭스에 적용합니다. 약 12,000 x g에서 1-2분 동안 컬럼을 원심분리하여 핵산이 컬럼에 결합하도록 하고 액체 플로우 스루를 버립니다.

세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 다시 원심분리합니다. 컬럼을 새로운 멸균 1.5mL 저접착력 마이크로분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 RNA를 분해하는 효소인 RNase가 없는 물을 컬럼에 추가하고 30초 동안 원심분리하여 RNA를 용리합니다. 용출된 RNA는 -80 ? C를 사용할 때까지.

실험 전에 특정 미생물의 존재에 대한 마커 역할을 할 수 있는 관심 염기서열을 검출하기 위해 적절한 프라이머를 설계해야 합니다.

-20 ? C를 사용하고 냉동 시약을 얼음(또는 실온)에서 해동합니다. 여기에는 뉴클레오티드(nucleotide), 역전사 완충액(reverse transcription buffer) 및 프라이머(primer)가 포함됩니다. 해동되면 시약을 얼음 위에 보관하십시오. 역전사효소 및 RNase 억제제는 항상 얼음 위에 보관해야 합니다.

시약이 해동되는 동안 반응 성분의 부피와 농도를 계산합니다. 시약이 해동되면 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 회전시켜 내용물이 잘 섞이도록 합니다.

오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 작업하고 각 PCR 튜브에 추가할 마스터 믹스의 구성 요소를 조립합니다. Eppendorf 튜브에 마스터 믹스를 조립할 때는 오염을 방지하기 위해 각 시약 사이에 피펫 팁을 교체해야 합니다. 모든 시약을 Eppendorf tube에 추가한 후 마스터 믹스 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 회전시켜 균일한 혼합물을 만듭니다.

PCR 튜브 세트에 라벨을 붙이고 대조군이 포함되어 있는지 확인합니다. 동일한 부피의 마스터 믹스를 각 튜브에 분취합니다. 그런 다음 음성 제어를 위해 RNA 추출물 또는 물과 같은 반응 특이적 성분을 추가합니다.

모든 구성 요소가 추가되면 튜브를 열 순환기에 넣고 역전사 프로그램을 실행하도록 설정합니다. 그런 다음 cDNA를 PCR 증폭에 적용할 수 있습니다. 이 단계에 대한 자세한 설명은 PCR에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

PCR이 완료되면 PCR 산물의 일부를 분리하여 아가로스 겔에서 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, RNA 바이러스의 존재를 검출하기 위해 유전자 특이적 프라이머가 여기에 사용되었습니다. 예상되는 크기의 띠는 RT-PCR 반응에서 얻어지지만 음성 대조군에서는 얻지 못하며, 이는 테스트 중인 물 샘플에 이 바이러스가 존재함을 나타냅니다.

RT-PCR에 의한 RNA 기반 미생물의 식별은 생태 건강, 환경 위험 및 생물 다양성 보존을 분석 할 수 있습니다.

오염된 토양과 물에서 탄화수소와 용제를 정화하기 위해 미생물을 사용하는 것은 생태 지속 가능한 복원 대안을 나타냅니다. 천연 미생물 유전자 발현을 이해하면 이러한 조건에서 오염 물질을 분해하는 특정 미생물 경로를 강조할 수 있습니다. RT-PCR은 종종 이러한 환경 샘플에서 mRNA를 증폭하는 데 사용됩니다.

공중 보건 조치는 종종 환경 내 바이러스 감염원에 대한 신속한 감시를 필요로 합니다. 예를 들어, 조류 인플루엔자는 전염성이 매우 높으며 가금류, 가축, 심지어 인간에게까지 빠르게 퍼질 수 있습니다. 이 특정 사례에서 연구자들은 야생 조류에 의해 전파되는 조류 인플루엔자의 위협을 찾았습니다.

휴대용 RT-PCR 설정 및 장치를 사용하여 감염을 조기에 감지하고 전염을 방지하기 위해 외딴 지역에서도 다양한 야생 조류를 검사했습니다.

마지막으로, RT-PCR은 북미의 포도 덩굴에 심각한 피해를 주는 질병의 숙주인 유리 날개 명사수인 Homalodisca vitripennis와 같은 해충을 표적으로 하기 위해 개발되고 있는 "생물 살충제"를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 곤충을 감염시키기 위한 병원체로 새로운 단일 가닥 RNA 바이러스가 개발되고 있습니다. 이 저자들은 Homalodisca 세포 배양과 바이러스 부하에 대한 RT-PCR 확인을 결합하여 생물학적 방제제로 사용하기 위해 고농도의 바이러스를 증식시킬 수 있었습니다.

RT-PCR에 의한 RNA 기반 환경 유기체 분석에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 이제 프로토콜의 이면에 있는 이론, 이 기술을 연구에 적용하는 방법, 그리고 오늘날 이 분야에서 사용되는 몇 가지 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!