RT-PCR을 사용한 환경 검체의 RNA 분석

1. 샘플 수집 : 토양 샘플

1. GPS, 좌표 또는 시력을 통해 샘플 위치를 찾습니다.
2. 무작위 샘플링의 경우, 미생물 서식지의 일반적인 인구 조사를 얻기 위해 지역 내에서 임의의 점을 선택합니다. Transect 샘플링은 스트림베드에 인접한 직선과 같은 지점에서 수집합니다. 그리드 샘플은 일정한 간격으로 지점에서 체계적으로 채취되며 알 수 없거나 가변 영역에서 미생물 커뮤니티를 매핑하는 데 유용합니다.
3. 3-6 인치 (7.5-15cm) 깊이 내에서 샘플링하면 뿌리 권부체 (식물 뿌리 및 관련 미생물에 의해 직접 영향을받는 토양의 좁은 영역)에 가깝지만 그 안에있는 가장 풍부한 미생물 활성에 대한 액세스를 제공합니다.
4. 토양 샘플을 수집하려면 손 오거를 땅에 밀어 넣고 미리 정해진 깊이로 비틀어 보냅니다.
5. 오거를 들어 올립니다. 토양은 오거의 중공 줄기 내에서 발견된다.
6. 오거 바닥의 토양을 토양 컬렉션 백으로 긁어 넣습니다. 토양을 만지거나 오염시키지 않도록 하십시오.
7. 가방의 위치, 이름, 날짜 및 시간으로 적절하게 라벨을 지정합니다.
8. 실험실에서 토양을 2mm 체로 통과하여 자갈과 바위를 제거합니다.
9. 토양 수분 함량에 대한 토양의 일부를 분석합니다. 이 단계에 대한 자세한 내용은 토양 수분에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

2. 샘플 수집 : 물 샘플

1. GPS, 좌표 또는 시력을 통해 샘플 위치를 찾습니다.
2. 수납병에 물을 채집합니다. 수집된 물의 양을 기록합니다. 시료내의 미생물이 정량적으로 분석되면, 미생물 농도는 수집된 부피에 기초하여 결정될 수 있다.
3. 적절한 전자 프로브를 사용하여 실험(온도, pH, 전도도, 염도, 질소 및 인 함량 등)에 필요한 모든 매개변수에 대해 즉시 물을 테스트합니다.
4. 물 샘플이 들어 있는 병을 얼음이 있는 쿨러에 넣습니다. 쿨러를 실험실로 옮기십시오.

3. RNA 추출

1. 환경 샘플에서 미생물을 수집하고 농축하려면 지역 사회 핵산 추출에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.
2. 제조업체의 지침에 따라 상용 추출 키트를 사용하여 바이러스에서 RNA를 추출합니다.
3. 먼저 에탄올로 보완된 리시스 버퍼와 샘플을 혼합한 다음 샘플을 스핀 컬럼에 추가합니다.
4. 약 12,000 x g의 컬럼을 원심분리하고 흐름을 폐기합니다. 열과 원심분리기에 버퍼를 다시 추가합니다.
5. RNase 가없는 물을 컬럼과 원심분리기에 30 초 동안 RNA를 멸균 1.5mL 저접착 미세 분리 튜브에 넣습니다.

4. 역 전사 - PCR

1. -20°C 냉동고에서 다음 시약을 검색: dNTP,농축(예를 들어,10x) 역전사 버퍼, 프라이머(이 예에서, 임의의 프라이머). 얼음이나 깨끗한 후드 내부의 실온에서 해동하고, 한 번 해동 얼음에 보관하십시오. 또한 역 전사및 RNase 억제제를 회수하고 얼음에 보관하십시오.
2. 모든 반응 중 모든 시약을 일정하게 결합하는 "마스터 믹스"를 만드는 데 필요한 시약 볼륨을 계산합니다(샘플 반응의 경우 표 1 참조). 모든 샘플에 대한 충분한 마스터 믹스뿐만 아니라 긍정적 인 제어 (알려진 성적 증명서 템플릿 사용) 및 음성 제어(예 :역 전사없이, 템플릿으로만 물) 반응을 준비합니다. 볼륨에 10%를 추가로 포함합니다.
3. 마스터 믹스를 1.5mL 저접착 마이크로퍼지 튜브에 조립합니다. 이것은 관의 플라스틱 벽에 시약 분자의 결합을 최소화합니다.
4. 시약이 해동되면 계산된 볼륨을 미세 분리 튜브에 추가합니다. 부드럽게 소용돌이와 원심 분리기 각 튜브추가 전에. 오염을 방지하기 위해 각 시약을 추가하는 것 사이에 파이펫 팁을 변경해야 합니다.
5. 모든 시약이 추가 된 후, 소용돌이와 원심 분리는 균일 한 혼합물을 보장하기 위해 마스터 믹스를 합니다. 시약을 -20°C에서 다시 저장에 넣습니다.
6. 8튜브 PCR 스트립을 준비하고 라벨을 부착하여 각 샘플 또는 제어 반응에 대해 하나의 튜브를 지정합니다.
7. 알리쿼트 각 튜브에 마스터 믹스의 동일한 볼륨. 이어서, RNA 추출물과 같은 반응 특이적 성분을 추가한다.
8. 스트립 캡을 PCR 스트립에 단단히 놓고, 스트립 튜브 어댑터가 있는 미니센트심분리기에 원심분리기를 배치하여 모든 액체가 각튜브(그림 2)의바닥에 수집되도록 합니다.
9. 온도 사이클러에 PCR 스트립을 안전하게 배치합니다. 튜브가 고정되도록 아래로 누릅니다.
10. 사용 중인 RT에 적합한 프로그램을 실행하도록 열순환기를 설정합니다(샘플 프로토콜의 표 2 참조). 프로그램이 완료되면 튜브에는 cDNA 제품이 포함되어 있으며, 이 제품에는 PCR 증폭이 가능합니다. 자세한 내용은 PCR 및 정량PCR의 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오. 사용 전까지 cDNA를 -20°C에 저장합니다.

그림 2. 마스터 믹스와 추출물을 함유한 8튜브 스트립을 덮었다.

시약	반응 1회당 부피(μL)
10x RT 버퍼	2.0
25배 dNTP	0.8
10x 랜덤 프라이머	2.0
멀티스크리브	1.0
Rnase 억제제	1.0
분자 등급 H2O	3.2
총 볼륨	10

표 1. RT 마스터 믹스 성분.

1단계	2단계	3단계	4단계
25°C, 10분	37°C, 120분	85°C, 5분	4 °C, ∞

표 2. RT 반응 열순환기 프로그램.