열 크로마토그래피
출처: 지미 프랑코 박사 연구소 - 메리맥 칼리지
컬럼 크로마토그래피는 화합물을 정화하는 데 가장 유용한 기술 중 하나입니다. 이 기술은 열에 포장된 고정 된 위상과 열을 통과하는 모바일 단계를 활용합니다. 이 기술은 화합물 사이의 극성의 차이를 악용하여 분자가 용이하…
1. 실리카 젤 슬러리
- 실리카 젤을 에를렌마이어 플라스크에 붓습니다. 포장 재의 무게는 분리되는 샘플의 약 50배여야 합니다. 분리되는 화합물이 매우 유사한 Rf 값을 가지고 있는 경우, 시료당 더 많은 양의 실리카를 사용해야 할 수 있으며, 이는 이 예의 경우이다.
- 에렌마이어 플라스크에 실리카 10g을 배치하면 50 mg의 샘플(플루오레네 45 mg, 테트라페닐포르피린 5 mg)가 분리되고 있기 때문에.
- 용매 시스템 추가(헥산/디클로로메탄, 70%: 30%) 실리카 젤을 함유한 에렌마이어 플라스크에. 모든 실리카 젤이 잘 솔레바닝되도록 충분한 용매를 추가합니다. 실리카는 녹지 않지만, 혼합물은 솔바드될 때 시각적으로 눈에 띄게 될 것입니다. 용매가 추가되면 모든 실리카가 잘 솔레바딩되도록 에를렌마이어 플라스크가 소용돌이치기 위해 날아다닌다.
2. 열 준비
- 적절한 크기의 열을 선택합니다. 일반적으로 컬럼은 실리카 젤 슬러리와 약 절반 정도 채워져야 합니다. 시료가 정결될수록 필요한 컬럼이 커지는 것입니다.
- 기둥의 바닥을 유리 양모 조각으로 연결합니다. 긴 막대를 사용하여, 양모가 스톱콕 바로 위에 있는 기둥의 바닥에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
- 울이 단단히 제자리에 있으면, 유리 울 위에 얇은 모래층을 바레게 발라주세요.
참고: 컬럼에 스톱콕 위에 유리 프릿이 장착되어 있는 경우 이 단계를 생략해야 합니다. - 수직 위치에 있는 열을 링 스탠드에 고정합니다.
- 깔때기를 사용하여, 부드럽게 기둥에 실리카 젤의 준비 슬러리를 부어. 에렌마이어 플라스크에서 기둥으로 슬러리를 전송하기 위해 용매를 추가해야 할 수 있습니다. 파이펫을 사용하여 컬럼 의 측면에 달라붙는 실리카 젤을 씻어 내보실 수 있습니다.
- 실리카 젤이 기둥에 침전되면 컬럼의 측면을 부드럽게 탭하여 실리카 젤이 단단히 포장되어 기포를 제외합니다.
- 스톱콕을 열고 용매가 실리카 젤과 용매 전면이 만나는 직전까지 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크로 배출되도록 합니다. 실리카 젤은 절차가 완료될 때까지 건조해서는 안됩니다.
- 실리카 젤 위에 얇은 모래층을 놓습니다(도1). 파이펫을 사용하여 열 측면에 붙어있을 수있는 모래를 씻어 내보도록하십시오.
- 모래가 건조할 때까지 추가 용매를 배출하지만 실리카 젤 층까지는 빼내십시오.
그림 1. 시료를 첨가하기 전에 컬럼 크로마토그래피 실험에 대한 적절한 설정.
3. 컬럼에 샘플 추가
- 가능한 가장 적은 양의 용매로 샘플을 용해하십시오(실리카 젤 슬러리를 만드는 데 사용된 동일한 용매를 사용함).
- 파이펫을 사용하여 컬럼 상단에 샘플을 부드럽게 추가합니다.
- 샘플이 컬럼 의 상단에 적용되면 스톱콕을 열고 용매가 모래 층을 통해 배수하지만 실리카 젤 층은 배출 할 수 있습니다. 매우 적은 양의 용매를 사용하여 컬럼 의 측면에 달라 붙었을 수 있는 모든 샘플을 씻어내도록 합니다. 모래 층을 통해이 추가 용매를 배출.
4. 컬럼을 통해 샘플을 보례
- 파이펫을 사용하여 모래 층을 방해하지 않는 방식으로 4-5 mL의 용매를 매우 부드럽게 추가합니다.
- 깔때기를 열 상단에 놓고 열을 매우 천천히 채우고 열의 나머지 부분을 용매로 부드럽게 채웁니다.
- 스톱콕을 열고 용매가 열을 통해 배수되도록 합니다.
- 컬럼에서 테스트 튜브로 배출되는 이동 상수집을 시작합니다.
- 테스트 튜브는 순차적으로 테스트 튜브 랙에 배치해야합니다.
- 원하는 모든 화합물이 컬럼에서 용출될 때까지 필요에 따라 열 상단에 추가 용매를 추가합니다.
5. 선거구 민생 회복
- 화합물이 착색되면 시각적으로 식별 할 수 있습니다. 그러나 화합물이 무색인 경우, 울타 가시광선(UV) 광(화합물이 균주를 포함하는 경우) 또는 적절한 얼룩을 사용하여 식별되어야 합니다. 화합물의 순도는 얇은 층 크로마토그래피를 사용하여 확인할 수 있습니다.
- 원하는 화합물을 포함하는 테스트 튜브를 식별합니다.
- 원하는 절연 화합물(들)을 포함하는 모든 분획을 미리 계량된 라운드 바닥(RB) 플라스크로 병합합니다. 격리되는 각 화합물에 대해 이 작업을 수행합니다.
- 회전 증발기에 RB 플라스크를 배치하여 용매를 증발시다.
- 모든 용매가 제거되면 건조 된 제품으로 RB를 계량하고 RB의 초기 중량을 빼서 수율을 얻습니다.
컬럼 크로마토그래피는 용액에서 화합물을 분리하는 데 사용되는 다목적 정제 방법입니다. 용액 혼합물은 고정상(stationary phase)이라고 하는 흡착성 고체를 포함하는 컬럼을 통해 용매에 의해 운반됩니다. 결합된 용매와 샘플 혼합물을 이동상이라고 합니다.
이동상의 분자는 화학적 특성과 고정상에 대한 친화력에 따라 다른 속도로 컬럼을 통해 이동합니다. 따라서 각 화합물은 서로 다른 시간에 열을 종료합니다. 화합물이 분리 및 정제되면 추가 가공이 가능하거나 분배할 준비가 됩니다. 이 동영상은 컬럼 크로마토그래피의 기초를 소개한 다음 유기 화합물을 정제하는 기술을 보여줍니다.
컬럼 크로마토그래피에서 분자는 컬럼을 통해 흐를 때 고정상에 가역적으로 흡착되어 진행 속도를 늦춥니다. 고정상과 약하게 상호 작용하는 화합물은 컬럼에서 빠져나가거나 용리되는 속도가 빠릅니다. 고정상과 강하게 상호 작용하는 화합물은 용리 속도가 느립니다. 고정상은 실리카겔 또는 알루미나와 같은 흡착성 분말 또는 겔입니다. 실리카겔과 알루미나는 극성이 높기 때문에 극성 화합물 및 용매와 강하게 상호 작용하고 비극성 분자와는 약하게 상호 작용합니다. 고정상은 용매와 함께 슬러리로 컬럼에 적재된 다음 고정상을 통해 유동 용매에 의해 충전됩니다. 적절하게 패킹되면 고정상은 위에서 아래로 균일하며 이러한 불규칙성으로 인한 불균일한 흐름이 화합물 분리를 방해하기 때문에 기포나 건조한 패치를 포함하지 않습니다. 용매 또는 용리액은 일반적으로 저장소에서 공급되는 유기 용매입니다. 일반적으로 비극성 용매는 비극성 화합물만 용리하는 반면, 극성 용매는 극성 및 비극성 화합물을 모두 용리합니다. 혼합물에 극성이 현저히 다른 화합물이 포함되어 있는 경우, 점점 더 극성이 증가하는 일련의 용매를 사용하여 관심 있는 모든 화합물을 용리시킬 수 있습니다. 이동상 유량은 일반적으로 컬럼 하단의 스톱콕에 의해 제어됩니다. 화합물의 확산을 방지하기 위해 흐름의 일시 중지는 최소한으로 유지됩니다. 용리액(eluate)이라고 하는 컬럼을 떠나는 이동상은 화합물의 분리를 보존하기 위해 분획으로 수집됩니다. 이제 컬럼 크로마토그래피의 원리를 이해했으므로 유기 화합물 혼합물을 정제하는 절차를 살펴보겠습니다.
절차를 시작하려면 텍스트에 명시된 대로 장비를 구하십시오. 분리할 각 화합물에 대해 바닥이 둥근 플라스크의 무게를 측정하고 질량을 기록합니다. 다음으로, 샘플의 무게를 측정하고 필요한 최소 용량의 용매로 용해시킵니다. 적절한 용매는 박층 크로마토그래피를 사용하여 미리 결정해야 합니다. Rf 값은 0.2?0.3 사이여야 합니다. 그런 다음 TLC 사전 스크리닝을 기반으로 샘플의 건조 중량과 관심 화합물의 이동 거리 차이를 기준으로 고정상에 필요한 실리카겔의 양을 결정합니다. 적당량의 실리카겔을 삼각 플라스크에 붓습니다. 슬러리가 반투명해지고 플라스크가 소용돌이칠 때 자유롭게 움직일 때까지 실리카겔에 용매를 추가합니다. 다음으로, 실리카겔이 반쯤 채울 수 있을 만큼 충분히 큰 컬럼을 선택합니다. 기둥에 유리 프릿이 없으면 유리솜을 기둥에 넣고 긴 막대로 바닥까지 단단히 누르십시오. 실리카가 유리솜을 통과하지 않도록 유리솜을 약 2cm의 모래로 덮습니다. 흄 후드에서 컬럼을 링 스탠드에 고정하여 시험관을 수용할 수 있는 충분한 공간을 확보합니다.
깔때기를 기둥에 놓고 마개가 닫혀 있는지 확인합니다. 슬러리를 컬럼에 붓고 슬러리가 기포를 제외하기 위해 가라앉을 때 측면을 부드럽게 두드립니다. 깔때기, 플라스크 및 컬럼 벽을 용매로 헹구어 모든 겔을 컬럼으로 옮깁니다.
기둥 아래에 삼각 플라스크를 놓습니다. 마개를 열고 용매 수준이 실리카겔 바로 위에 있을 때까지 용매가 플라스크로 배출되도록 한 다음 마개를 닫습니다. 젤에 약 2cm의 모래를 붓습니다. 솔벤트로 컬럼 측면에 붙은 모래를 부드럽게 헹굽니다. 필요에 따라 용매를 배출하여 모래가 대부분 건조되도록 하지만 실리카는 완전히 덮인 상태로 유지합니다.
분리를 시작하려면 모래를 방해하지 않고 샘플을 컬럼에 추가하십시오. 소량의 용매를 사용하여 컬럼 벽에 부착된 샘플을 헹구고 샘플 용기를 헹굽니다. 수준이 실리카 바로 위에 올 때까지 용매를 조심스럽게 배출합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 모래 층을 방해하지 않고 4?5mL의 용매를 부드럽게 첨가하십시오. 깔때기를 컬럼에 놓고 천천히 용매를 채웁니다. 플라스크를 제거하고 라벨이 붙은 시험관으로 교체합니다. 첫 번째 시험관이 제자리에 있는 상태에서 마개를 열고 시험관이 거의 가득 찰 때까지 용출액을 수집합니다.
원하는 모든 화합물이 용리될 때까지 분획을 계속 수집하고, 라벨링된 시험관을 통해 순차적으로 진행합니다. 완료되면 마개를 닫습니다.
분리된 각 화합물에 대해 순수한 분획을 미리 계량된 둥근 바닥 플라스크에 결합합니다. 회전 증발기의 플라스크에서 용매를 제거한 다음 건조 화합물이 들어있는 둥근 바닥 플라스크의 무게를 잰다. 자세한 내용은 회전 증발에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.
이 샘플에는 테트라페닐포르피린(TPP)과 플루오레논이 혼합되어 있었습니다. 짙은 적자색 TPP가 먼저 용출된 후 노란색 플루오레논이 용출되었습니다. 각 분리된 화합물의 순도는 NMR 분광법으로 확인되었습니다.
컬럼 크로마토그래피는 다양한 과학 분야의 정제 및 분석에 사용됩니다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 화합물 간의 탁월한 분리를 제공하는 컬럼 크로마토그래피의 한 형태로, 방사성 표지된 분자에 대한 방사선 검출기와 같은 특수 검출기를 통합할 수 있습니다. HPLC를 사용하면 방사성 표지된 인지질은 혼합물의 작은 퍼센트를 구성하더라도 다른 많은 혼합물의 혼합물에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 이 정보는 많은 중요한 생체 분자의 생산, 조절 및 기능을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
플래시 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피의 변형으로, 이동상이 중력 흐름만으로는 되지 않고 공기 또는 기체 압력 하에서 컬럼을 통해 이동합니다.
이렇게 하면 유속이 더 빨라지고 확산이 최소화되어 분리가 향상됩니다. 원하는 화합물은 박층 크로마토그래피에서 볼 수 있듯이 몇 개의 순수하고 농축된 분획으로 수집되어 우수한 정제 후 수율과 순도를 제공합니다.
일반적인 컬럼 장치는 소량을 분리하는 데 적합하지 않지만 일부 혼합물은 HPLC와 같은 특수 기술과 호환되지 않습니다. 소규모 정제는 유리 피펫 컬럼을 사용하여 수행되며, 피펫 전구는 소규모 플래시 크로마토그래피에 사용됩니다. 이는 특수 정제 기술을 위해 시료를 준비할 때 또는 대규모 정제 후 최종 단계로 특히 유용합니다.
방금 JoVE의 컬럼 크로마토그래피 소개를 시청하셨습니다. 이제 컬럼 크로마토그래피의 원리, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피의 절차 및 이 기술의 몇 가지 응용 분야에 대해 잘 알게 되었을 것입니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
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Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.