복부 대동맥류의 근적외선 형광 영상

근적외선 형광 이미징은 형광 프로브를 사용하여 조직의 복잡한 생체 분자 어셈블리를 시각화하는 광학 기술입니다. NIRF라고도 하는 이 비침습적 이미징 기술은 빠르며 전리 방사선이 필요하지 않습니다.

NIRF에서 형광 프로브는 암 및 심혈관 질환 진행을 연구하기 위한 더 높은 특이성을 위해 작은 분자와 결합할 수 있습니다. 그들은 조직 깊숙이 침투하는 근적외선에 의해 여기되며 이러한 표적 분자의 농도를 변경하는 병든 조직에서 건강한 조직을 설명하는 데 사용될 수 있습니다.

이 동영상은 근적외선 형광 이미징의 원리와 다양한 질병을 연구하기 위해 작은 동물을 대상으로 in vivo 및 ex vivo 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

이름에서 알 수 있듯이 근적외선 형광 이미징은 650나노미터에서 900나노미터 범위의 첫 번째 근적외선 창 내의 빛을 활용하여 광자를 조직으로 전달합니다. 형광단(fluorophore)이라고 하는 표적 특이적 형광 분자는 일반적으로 이미징 전에 유전 공학 또는 주입을 통해 동물에 도입됩니다.

이 형광단은 광자 에너지를 흡수하여 분자의 에너지를 기저 상태 S0에서 불안정한 여기 상태 S1 프라임으로 높입니다. 이 상태는 불안정하기 때문에 분자는 여기 상태 내에서 가장 낮은 진동 에너지 수준으로 이완되어 에너지를 열의 형태로 방출합니다. 이제 이완된 여기 상태 S1에 있는 형광단은 다시 바닥 상태로 돌아가 특정 파장의 빛을 방출합니다.

이 빛은 분자가 가장 낮은 진동 에너지 수준으로 이완됨에 따라 열의 형태로 소산되는 에너지로 인해 원래 형광단에 도입된 빛보다 파장이 더 깁니다. 그런 다음 방출된 빛을 캡처하고 형광 이미징 시스템을 사용하여 기록합니다.

형광단에 대한 흡수 및 방출 스펙트럼 그래프는 형광단이 각각 흡수하고 방출할 수 있는 파장의 범위를 보여줍니다. 피크 흡수와 피크 방출 파장 사이의 나노미터 단위의 차이인 이 근본적인 이동을 스톡스 시프트(Stokes shift)라고 합니다. 각 형광단에는 뚜렷한 스톡스 시프트(Stokes shift)가 있어 방출광과 여기광을 구별할 수 있고 NIRF와 같은 이미징 기술을 가능하게 합니다.

근적외선 형광 이미징의 주요 원리를 검토했으므로 이제 동물을 준비하고 이미지화하는 단계별 절차를 살펴보겠습니다.

먼저, 광섬유 광 가이드를 사용하여 광섬유 광원을 형광 이미징 시스템에 연결합니다. 샘플에 도입할 형광의 excitation 스펙트럼과 일치하는 excitation filter를 선택하여 올바른 파장의 빛이 전달되도록 합니다.

다음으로, 형광단의 방출 스펙트럼과 일치하는 적절한 방출 필터를 선택하여 자가형광에 기인할 수 있는 원치 않는 스펙트럼 성분을 차단합니다.

생체 내 이미징 준비를 시작하려면 이소플루란을 사용하여 녹다운 챔버에서 동물을 마취합니다. 이미징 스테이지에 고정된 콧방울로 동물을 옮깁니다. 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 동물의 발을 고정합니다. 제모 크림을 바르고 관심 부위의 털을 제거합니다. 그런 다음 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 바릅니다.

그 후, 활성 형광 분자 프로브를 동물에 주입합니다. 이미지 획득을 시작하려면 분자 이미징 소프트웨어를 엽니다. 광섬유 광원과 형광 이미징 시스템을 모두 켭니다.

그런 다음 획득 창을 열고 연구에 적합한 노출 유형을 지정합니다. 사용 가능한 노출에는 단일 이미지를 캡처하는 표준 노출, 고정된 시간 간격 동안 일련의 이미지를 캡처하는 타임랩스 노출, 서로 다른 노출 시간에서 연속적인 노출 시퀀스를 캡처하는 프로그레시브 노출이 포함됩니다.

그런 다음 UV 투과를 조명 소스로 선택합니다. 미리보기 이미지를 참조로 사용하여 캡처 시스템 챔버에서 초점, 시야 및 F-스톱을 조정하여 샘플링된 이미지 품질을 최적화합니다. 필요에 따라 샘플의 노출 시간과 위치를 조정합니다. 그런 다음 미리보기 창을 닫습니다. 획득 창의 모든 매개변수가 카메라 및 필터 설정과 일치하는지 확인합니다. "노출"을 클릭하여 이미지를 획득하고 저장합니다.

체외 이미징을 준비하려면 형광 프로브를 주입한 후 인도적인 방식으로 동물을 안락사시킵니다. 집게를 사용하여 과도한 대동맥 주위 지방을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 관심 조직이나 기관을 외과적으로 추출합니다. 잔여 혈액을 제거하기 위해 인산염 완충 식염수로 조직을 헹굽니다. 그런 다음 샘플을 이미징 스테이지에 직접 놓습니다.

in vivo 이미징을 위해 설명된 것과 동일한 프로토콜에 따라 ex vivo 조직을 이미지화합니다. 완료되면 스테이지에서 샘플을 제거합니다. 시스템을 끄고 이미징 스테이지를 청소합니다.

이제 근적외선 이미지를 얻기 위한 프로토콜을 완료했으므로 이러한 스캔 결과를 검토해 보겠습니다.

이러한 대표적인 이미지에서는 꼬리 정맥을 통해 활성화 가능한 형광 프로브를 전신적으로 주입하여 매트릭스 금속단백분해효소(MMP2)를 시각화합니다. 여기에서 우리는 안지오텐신 II를 주입한 후 복부 대동맥류가 발생한 아포지단백-E 결핍 마우스의 생체 내 NIRF 이미지를 볼 수 있습니다. 신호가 높은 작은 반점의 대부분은 피부 자가형광에서 비롯된 것이지만, 혈관 구조는 시각적으로 높은 형광 신호를 가진 관 구조로 나타납니다.

두 번째 대표 이미지는 두 가지 다른 동물 모델의 복부 대동맥류에 대한 NIRF 이미지를 비교합니다. 하나는 안지오텐신 II가 주입된 아포지단백-E 결핍 마우스의 최후 복부 대동맥류입니다. 그리고 두 번째는 돼지 췌장 엘라스타아제를 주입한 쥐의 근막 복부 대동맥류입니다.

각각에서 복부 대동맥의 동맥류 부위에서 MMP2 활성이 증가하는 것을 볼 수 있습니다. 과도한 형광 프로브는 여과되어 신장에 축적되어 그곳에서 관찰되는 밝은 형광 신호를 설명합니다.

이제 근적외선 필드 이미징의 다른 응용 분야를 살펴 보겠습니다. 첫째, NIRF 이미징은 쥐 모델에서 심혈관 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 연구에서는 녹아웃 마우스에 두 개의 서로 다른 근적외선 형광 프로브를 주입합니다. 대동맥은 24시간 후에 채취되어 NIRF 이미징을 통해 평가됩니다. 결과는 유의미한 NIRF 반응을 보여주며, 이는 대식세포 축적과 함께 위치하는 광범위한 석회화가 존재함을 나타냅니다.

NIRF 이미징은 in vivo에서 종양을 찾고 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 형광 종양 시뮬레이션 내포물을 포함하는 유방 팬텀을 시뮬레이션하는 조직을 생성합니다. 그런 다음 유방 보존 수술 중 NIRF 이미징의 적용을 시뮬레이션합니다.

결과는 종양과 유사한 내포물이 NIRF에 의해 약 2cm 깊이까지 검출될 수 있음을 보여줍니다. 이보다 더 깊은 내포물은 겹쳐진 환상 조직을 절개한 후에 검출할 수 있습니다. 내포물을 제거한 후 외과의는 NIRF 이미지를 평가합니다. 종양의 존재를 나타내는 남아있는 형광은 불완전한 제거를 나타내며 그 후 절제됩니다.

방금 JoVE의 근적외선 이미징 소개를 시청했습니다. 이제 형광단 여기 및 방출의 원리, in vivo 및 ex vivo NIRF 이미징을 위해 동물을 준비하는 방법 및 일부 생물 의학 응용 분야를 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!