성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

본 논문에서 우리는 성인 쥐 심장 myocytes를 분리하고 문화에 전형 방법을 설명했다. Collagenase와 단백 분해 효소는 단일 myocytes을 소화하고 격리하는 데 사용됩니다. Myocytes는 대부분의 실험 요구 사항을 충족이 프로토콜을 따라 교양.

이 절차는 성체 쥐의 심장을 절제하여 관류 시스템에 매달아 놓는 것으로 시작됩니다. 효소 용액은 약 30분 동안 관류된 후 심장을 제거합니다. 다진 효소 소화는 작은 비커에서 계속될 수 있습니다.

분해가 끝나면 세포는 기계적 교반에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고 멸균 튜브로 여과됩니다. 일차 심장 세포는 칼슘 농도가 증가하는 완충액에서 3회 세척하고, 배양액, 배지에 재현탁하고, 라미네이트 코팅된 조직 배양 접시에 도금합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 물리학과 생리학 및 세포학과의 Henry Cowa 실험실에서 근무하는 Shahi입니다.

오늘은 다른 쥐의 심장 세포를 분리하고 배양하는 절차를 소개한다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 심장의 칼슘 채널을 연구합니다. 시작하겠습니다.

쥐 수술 전날에는 모든 용액이 만들어졌는지 확인하되 아직 효소를 추가하지 마십시오. 완충액 A B 및 세척 완충액은 모두 섭씨 4도에서 보관하기 전에 멸균 여부를 위해 여과해야 합니다. 6개의 웰 조직 배양 플레이트는 전날에도 라미네이트 용액으로 도금하고 CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 보관해야 합니다.

수술 당일. 클램프 가위와 집게를 70% 에탄올로 소독하여 수술 기구를 준비하고 종이 타월로 말리십시오. 반 밀리리터의 헤파린 용액으로 채워진 1밀리리터 주사기가 준비됩니다.

이제 연동 펌프를 반대로 사용하여 70 % 에탄올을 통과하는 관류 장치를 세척하는 것이 좋습니다. 완료되면 에탄올로 헹구고 이중 증류수로 장치를 헹구고 마지막으로 버퍼로 헹굽니다.A. 흐름을 통해 비이커에 모여 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 세척된 풍성 장치를 준비하기 위해 오른쪽 주사기 튜브에 40ml의 완충액 A를 채우고 왼쪽 주사기 튜브에 40ml의 완충액 B를 채웁니다. 완충액 A가 장치를 통해 흐르도록 하여 관류 튜브를 카테터 끝에 프라임합니다.

주사기를 40ml 수준으로 완충액을 다시 채웁니다. 이 단계 후에 튜브에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하고, 이제 버퍼를 차단하고, 스톱 콕 밸브가 있는 주사기를 사용하고, 풍요로운 튜빙이 이제 완충액으로 프라이밍되도록 프로세스를 반복합니다. B. 풍력 장치가 마침내 준비되고 버퍼와 함께 남습니다. B 스톱 콕 밸브가 열렸지만 흐름이 멈췄습니다.

IV 라인의 조절기를 사용하여 수집 비커에서 버퍼 흐름을 폐기합니다. 수술 전에 마지막으로 해야 할 일은 원액에 필요한 효소를 첨가한 다음 전날 다른 용액을 여과한 것처럼 효소 용액을 여과하는 것입니다. 여과가 완료되면 이 용액은 표준 프로토콜에 따라 실온에 그대로 둘 수 있습니다.

가스실에서 iso 불소로 쥐를 안락사시킵니다. 흉부의 절개 부위를 70% 에탄올로 소독합니다. 가위를 사용하여 가슴을 열고 마음을 드러냅니다.

좌심실에 0.5ml의 헤파린 용액을 주입합니다. 대동맥의 많은 부분이 손상되지 않은 상태로 심장을 제거합니다. 즉시 카테터를 대동맥에 삽입하십시오.

전형적인 쥐의 심장은 건강한 막대 모양의 근세포의 비율이 높고 죽은 둥근 세포는 거의 생성되지 않아야 합니다. 다음 절차를 올바르게 준수하면 대동맥을 카테터에 고정하기 시작합니다. 관상동맥을 통한 심장의 원활한 관류를 보장하기 위해 카테터의 끝을 심장 안으로 너무 멀리 밀어 넣지 않아야 합니다.

일단 고정되면 봉합사로 대동맥을 카테터에 묶습니다. 다음으로, IV 라인 레귤레이터를 열어 빠른 드립 속도를 허용하고 버퍼 꿀벌이 완충 꿀벌 세척 중에 심장을 씻어낼 수 있도록 합니다. 작은 가위와 집게를 사용하여 심방과 심장에 달라붙은 지방 또는 폐 조직을 제거합니다.

버퍼 B가 완료되면 흐름을 잠시 버퍼링으로 전환합니다. 버퍼 A는 5분 동안 흐를 수 있습니다. 효소 용액을 섭씨 37도의 수조에서 데웁니다.

완충액 A가 주사기에서 고갈되었지만 튜브에 여전히 존재하는 경우 풍요로운 장치의 주사기 A에 50ml의 효소 용액이 적재됩니다. 이제 효소 용액이 심장을 정독할 때까지 수조의 수집 비커에서 통과하는 모든 흐름을 버려야 합니다. 효소 용액이 심장을 정독하자마자 효소 용액을 수집 비커에서 보충된 주사기로 옮기도록 설정된 연동 펌프를 활성화합니다.

A: 효소 용액이 심장을 통해 10분 동안 흐르도록 합니다. 심장이 소화됨에 따라 37.5마이크로리터의 0.1몰 염화칼슘이 주사기 A의 효소 용액에 부풀어 오르기 시작하여 0.1밀리몰의 칼슘의 유효 농도를 제공합니다. 이것은 10 분 후에 농도를 증가시키기 위해 사용되는 여러 염화칼슘 첨가물 중 첫 번째이며, 주사기 A에 0.1 몰 염화칼슘 50 마이크로리터를 추가로 첨가하여 칼슘 농도를 0.2 밀리 몰로 증가시키고 10 분 동안 더 풍부하게 진행하도록합니다.

10분이 경과한 후 심실을 절단하고 비커에 20ml의 효소 용액이 들어 있는 작은 멸균 비커로 심장을 옮깁니다. 0.1 몰 염화칼슘 40 마이크로 리터를 더 첨가하여 칼슘 농도를 0.4 밀리 몰로 늘리고 작은 멸균 가위로 심장을 10 개 이상의 조각으로 부드럽게 다집니다. 이제 섭씨 37도에서 비커를 부드럽게 흔들며 배양합니다.

배양 5분 후, 0.1몰 염화칼슘 40마이크로리터를 첨가하여 0.6밀리몰 칼슘의 유효 농도를 제공하고 섭씨 37도에서 추가로 5분 동안 배양한 후 플라스틱 전사 피펫으로 심장 조각을 3-5회 부드럽게 반복하고, 0.1몰 염화칼슘 40마이크로리터를 추가하고 이전과 같이 부드럽게 반복합니다. 멸균 500마이크로미터 필터를 사용하여 소화되지 않은 결합 조직에서 소화된 단일 근세포를 분리합니다. 세포가 실온에서 10분 동안 50ml 튜브에 침전되도록 하고, 저크, 전사 VI로 상층액을 버리고, 세척 버퍼 번호 1에 세포를 부드럽게 재현탁시키고, 세포가 침전하는 동안 실온에서 10-20분 동안 세포가 침전되도록 합니다.

작은 부분 표본을 가지고 이 시간을 도립 현미경으로 현탁액 세포의 품질과 생존력을 평가할 수 있는 기회로 사용하십시오. 좋은 제제는 파삭 파삭 한 줄무늬가있는 세포와 같은 막대의 비율이 높습니다. 세포가 정착되면 스내트를 버리고 세척 버퍼에 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

둘째, 세포를 실온에 정착시키고, 다시 10-20분이 소요되고 상등액을 버립니다. 세포를 조직 배양 플레이트로 옮기기 전에 5% 혈청 배지에 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 하나의 XSFM으로 플레이트를 세척합니다.

원하는 밀도로 세포를 옮기고 CO2 조직 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 3-5시간 동안 배지를 하나의 XSFM 세포로 전환하면 최대 4일 동안 배양할 수 있으며 실험에 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 프로토콜이 올바르게 수행될 때 도립 현미경 하에서 70% 이상의 살아있는 심장 근세포가 있어야 합니다.

이들은 48시간 동안 배양된 후 YFP REM으로 transfection된 분리된 근세포입니다. 이러한 품질의 세포는 일반적으로 이 절차에서 배양됩니다. 우리는 단지 분리하는 방법을 보여드릴 것이고 배양은 뜨거운 세포입니다.

이 절차를 수행할 때 가능한 한 빠르고 깨끗하게 해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.