포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

이 비디오에서는 포유류 세포주에서 NHEJ 또는 HR에 의한 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 효율성과 정확성을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 절차는 NHEJ 또는 HR 리포터 카세트의 염색체로 통합된 단일 사본을 포함하는 세포주를 생성하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 이러한 리포터 세포를 I SCE, 즉 플라스미드 및 DS red를 발현하는 1개와 플라스미드 1개의 혼합물로 transfection합니다.

나는 느낀다. 하나의 엔도뉴클레아제는 리포터 구조체에서 이중 가닥 절단을 생성하고 DS RED는 형질주입 대조군 역할을 합니다. 그런 다음 원하는 경우 NHEJ 또는 HR의 효율성을 정량화하기 위해 GFP 양성 및 DS 적색 양성 세포의 백분율을 팩스로 분석합니다.

수리의 충실도는 대장균에서 리포터 제품을 구출하고 수리 제품을 시퀀싱하여 분석합니다. 이러한 방식으로, 주어진 세포주에서 이중선 가닥 파괴 또는 DSB 복구의 효율성과 충실도는 복구 이벤트의 유세포 분석 정량화 및 복구 산물의 염기서열분석을 기반으로 결정됩니다. 이 방법은 이중 스트링 브레이크 수리를 분석하기 위한 기존 방법에 비해 많은 장점이 있습니다.

우선, 이 방법은 상동 재결합과 비상동 및 결합을 구체적으로 구별합니다. 그런 다음 이 방법은 매우 정량적이어서 유세포 분석으로 수백만 개의 세포를 분석할 수 있으며, 항생제 내성 cls를 선택하기 위해 복구가 완료된 후 세포를 광범위하게 패키징할 필요가 없습니다. 마지막으로 녹색 세포의 모습을 확인하여 복구 완료를 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.

또한 이 방법은 바이러스 돌연변이 세포 유형 또는 약물 치료 후 HR 및 HEGA 복구 효율 측정과 같은 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 주기의 여러 단계에서 A 복구를 검사하고 복구 속도를 측정하는 것이 일반적입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 우수한 transfection 효율을 달성하는 것이 중요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차에서. 두 개의 리포터 카세트는 이중 가닥 DNA 파손을 복구하기 위해 분석하는 데 사용됩니다. 하나의 카세트는 비상동 종단 결합 또는 N-H-E-J-D-N-A 수리를 검사하는 데 사용됩니다.

다른 하나는 상동 재조합을 보거나 HR DNA가 비상동 말단을 복구하는 데 사용됩니다. 리포터 카세트에 가입하면 PEM 1 유전자 또는 GFP PEM 1 유전자에서 조작된 3 kilobase 인트론이 있는 GFP 유전자가 포함되어 있습니다. 요컨대, P one intro는 이중 가닥 절단의 유도를 위한 힌디어 3 및 I SCE 1 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열 옆에 있는 아데노바이러스 엑손을 포함합니다.

I SCE one 사이트는 반전된 방향입니다 I SCE one은 비회문 인식 시퀀스를 가지므로 두 개의 반전된 사이트가 호환되지 않게 생성됩니다. DNA는 양립할 수 없는 끝입니다. DNA 말단은 자연적으로 발생하는 dss를 가장 잘 모방합니다.

정렬되지 않은 NAEJ 카세트는 아데노바이러스 엑손이 G-F-P-O-R-F를 방해하기 때문에 GFP 음성입니다. ISEE one에 의한 이중 가닥 DNA 절단의 유도 시 아데노바이러스 엑손이 제거되고 NHEJ가 GFP 유전자의 기능을 회복합니다. 상동 재조합 리포터 카세트도 HR 카세트의 GFP PEM one 구성을 기반으로 합니다.

G FP PEM one의 첫 번째 엑손은 3개의 제한 부위의 삽입과 결합된 22개의 염기쌍 결실을 포함합니다. I SCE 1 힌디어 3 I SCE E 1. 삭제는 GFP가 NHEJ 이벤트에 의해 재구성될 수 없도록 합니다.

I SCE one 사이트는 반전 방향입니다. 그래서 I SCE 1 소화는 양립할 수 없는 끝을 남긴다. GFP PMM 것의 첫번째 사본은 발기인 보다 적게 TG, GFP M1의 더 적은 첫번째 exon andt 소개에 선행된다. 온전한 구조체는 I sce E one 소화에 의한 이중 가닥 파손 유도 시 GFP 음성입니다.

기능적 GFP 유전자는 첫 번째 GFP PMM의 두 돌연변이 사본 사이의 유전자 변환 이벤트, 하나의 엑손, 단일 가닥 무릎 꿇기의 교차와 같은 다른 유형의 DSB 복구에 의해 재구성됩니다. 그리고 NHEJ는 GFP 유전자를 재구성하지 않습니다. GFP 유전자의 두 번째 사본이 부족하기 때문입니다.

교차하거나 단일 가닥 무릎을 꿇음에 의한 첫 번째 A TG 코돈 및 두 번째 엑손 해상도는 GFP 활성을 복원하지 않습니다. 따라서 이 설계는 포유류 세포에서 우세한 HR 경로인 유전자 변환에 의한 해상도를 독점적으로 검출할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 Kyogen의 엔도 프리 키트를 사용하여 고품질 NHEJ 스톡을 준비하거나 HR 리포터 플라스미드를 10마이크로그램의 플라스미드를 선형화하고 분해 용액에서 DNA를 정제합니다.

플라스미드 준비에 대한 자세한 내용은 동봉된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 형질주입을 준비하기 위해. 정상적인 인간 섬유아세포가 최상의 성장 조건에서 유지되는지 확인하십시오.

얼린 바이알에서 시작하는 경우, transfection하기 전에 세포를 두 번 분할합니다. 합류 세포의 플레이트에서 시작하는 경우, 세포는 한 번 성장하면 세포가 70-80 % 합류합니다. 이것은 100mm 판에 도금 된 다섯 번째 세포까지 5 곱하기 10에 약 2 일이 걸립니다.

최상의 transfection 효율을 위해서는 세포를 로그 성장 상태로 만듭니다. 활발하게 성장하는 배양액은 형질주입 수확을 위해 표면에 부착된 둥근 세포로 보이는 M 단계의 세포를 포함하며, 2개의 100mm 플레이트에서 6개의 세포 중 약 2배를 포함합니다. 세포의 80%가 플레이트에서 분리되자마자 세포가 트립신을 멈추는 트립신을 과도하게 사용하지 않는 것이 중요합니다.

NHDF 용액에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포는 NHDF 용액에 민감하기 때문에 배양 시간을 최소화하고 세포를 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, amaxa nucleo effector를 사용하여 정상적인 인간 섬유아세포에 대한 0.5마이크로그램의 선형화된 리포터 구조체로 세포를 transfection합니다.

이러한 형질주입 조건은 유전자 1밀리리터당 1밀리그램 또는 G 4 18에서 형질주입 후 24시간 동안 대부분의 integr 동안 리포터 구조체의 단일 사본의 통합을 초래합니다. 염색체가 통합된 리포터 구조를 가진 세포를 선택하려면, 7일에서 10일 동안 선택을 계속한 다음 개별 G 4 1 8 저항성 콜로니를 선택하거나 저항성 클론을 풀링합니다. 배양을 약 5개의 100mm 플레이트로 확장합니다.

나중에 사용할 수 있도록 3개의 플레이트를 동결하고 나머지 2개의 플레이트를 100mm 플레이트당 5번째 셀로 5배 10으로 확장합니다. 일반적으로 100mm 플레이트 10개는 5개의 트랜스펙트에 충분합니다. 도금 2일 후 리포터 구조체를 포함하는 세포가 70 내지 80%에 도달했을 때, I sce 1을 발현하는 플라스미드 5마이크로그램과 DS 레드 플라스미드 0.1마이크로그램의 혼합물과

transfection 효율 제어로, AM maxon nucleo effector를 사용하여 대수적으로 성장하는 배양액에서 6개의 세포 중 약 2배의 10개를 transfection합니다. DSP 효율은 GFP 양성 세포와 DS 적색 양성 세포의 비율로 측정되기 때문에 ISCE one과 DS 적색 플라스미드 혼합물의 변화가 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 플라스미드 품질은 또한 transfection 효율을 변화시킴으로써 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

따라서 일관된 측정을 얻으려면 하나의 실험 내에서 동일한 플라스미드 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다.동시에 각 대조군에 대한 사실에 대한 세 가지 검량 대조군을 준비합니다. 6개의 세포 중 약 2배의 10을 transfection합니다. 세 가지 대조군은 플라스미드를 발현하는 EGFP 5마이크로그램, DS 5마이크로그램, 적색 플라스미드 5마이크로그램 및 5마이크로그램입니다.

형광 단백질을 발현하지 않는 대조 플라스미드. transfection 3일 후, GFP 및 DS 검출을 위한 필터가 있는 형광 도립 현미경으로 transfection의 효율성과 GFP 및 DS red 단백질의 발현을 확인합니다. 빨간색은 팩스 분석 하루 전, 형질 주입 수확 후 4일 동안 세포를 성장시킵니다. I SCE 1 형질 주입된 세포와 대조 세포를 수확합니다. 이 단계에서는 모든 세포를 수확하고 둥근 모양의 세포를 갖는 것이 중요합니다.

이를 위해서는 더 긴 트립신 생성 시간 또는 더 높은 농도의 트립신을 사용하십시오. 현미경으로 세포를 검사하여 세포의 99%가 플레이트에서 분리되어 둥근 모양을 하고 있는지 확인합니다. 500마이크로리터의 PBS에 셀을 다시 매달아 팩스 튜브로 전송합니다.

세포를 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 채취 직후 세포를 분석하십시오. 다음으로, TFP DS RED와 네거티브 컨트롤을 사용하여 사실을 보정합니다.

모든 형광 세포를 분석에 포함시키기 위해 전압 및 색상 보정을 조정합니다. 실험 샘플의 형광 강도가 대조군의 형광 강도보다 낮다는 점을 명심하십시오. 대조군을 가진 사실을 측정한 후에, GFP와 ds 사이 잠재적인 방해를 방지하기 위하여 I SCE 1개의 transfectioned 세포를 각 처리에 대해 적어도 20, 000개의 세포를 조사하십시오 분석하십시오.

적색 형광은 GFP 양성 또는 DS red 양성 세포의 비율을 25% 미만으로 유지합니다.백분율이 더 높으면 DS RED 또는 I sce E 1 플라스미드의 양을 줄입니다. GFP 양성 세포의 퍼센트는 D-N-A-D-S-P 복구의 효율에 해당하고 DS 적색 양성 세포의 퍼센트는 형질주입의 효율을 나타냅니다. D-N-A-D-S-P 복구의 상대적 효율을 GFP 양성 세포와 DS 적색 양성 세포의 비율로 계산합니다.

복구된 명령의 정확성을 결정하기 위해 eco R one 효소 순환화로 게놈 DNA를 소화하고 유능한 대장균 세포로 변형시켜 리포터 구조를 구출합니다. 이러한 구출은 원래 구조가 제한, 분해 및 염기서열분석에 의해 분석된 복제의 박테리아 기원을 포함하고 있기 때문에 가능합니다. 이는 일반적인 사실, 대조군 절편 및 NHEJ 및 HR 실험의 결과입니다.

형광 강도와 형광 세포의 수는 대조군에 비해 I SCE 1 형질 주입 세포에서 더 낮습니다. 형광 신호의 차이는 이러한 세포에서 GFP 및 DS RED 구조체의 복제 수 차이에 기인합니다. 실험의 각 셀에는 Integrated Reporter 구문의 사본 하나가 포함되어 있습니다.

따라서 성공적인 복구 이벤트는 세포의 일부에서 GFP 유전자를 재구성합니다. NHEJ 및 HR의 효율성은 GFP 양성 세포와 DS 적색 양성 세포의 비율로 계산됩니다. NHEA는 인간 세포에서 HR보다 더 효율적인 프로세스이며, 인간 섬유 아세포에서 NHEJ 효율은 일반적으로 0.6에서 1.3이고 HR 효율은 0.05에서 0.3입니다.

이 기술은 DNA 복구 분야의 연구자들이 HEG 및 HR에서 다양한 요인의 역할을 탐색하고 포유류 세포에서 NHEG 및 HR의 동역학 및 규정을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 분석을 사용하여 포유류 세포에서 HR 및 GJ의 효율성과 정확성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.