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- 먼저, NMJ 또는 신경근 접합부의 다양한 측면을 강조하는 마커가 있는 면역염색 초파리 유충. 이것은 운동 뉴런 축삭의 끝이 근육과 접촉하는 영역이며, 그 형태는 시냅스 기능의 판독값으로 사용됩니다.
축삭은 부통(boutons)이라고 하는 돌출부를 형성하는 여러 가지에서 끝납니다. 신경 전달 물질은 부통에서 방출되어 근육 수축을 일으킵니다. 신경전달물질이 분비되는 영역을 활성 영역이라고 합니다. 여기서 하나의 마커는 NMJ의 윤곽을 그리는 시냅스 단백질에 특이적이고, 다른 마커는 활성 영역에 존재하는 단백질에 대한 것입니다.
다음으로, 현미경을 사용하여 NMJ 이미지를 획득하고 반자동 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형태를 정량적으로 평가합니다. 사전 설정된 일련의 소프트웨어 명령을 이미지에 적용합니다. 출력 파일에는 분석된 NMJ 이미지와 형태학 결과가 포함되어 있습니다. 측정할 수 있는 특징에는 부통의 수와 표면적, NMJ 길이 및 분기 수, 연결되지 않은 NMJ 구획 수, 활성 영역 수가 포함됩니다.
다음 예에서는 시냅스후 마커인 DLG1과 활성 영역 마커인 BRP로 염색된 초파리 NMJ의 형태를 분석합니다.
- 이 프로토콜의 경우 NMJ의 이미지 스택을 생성하고 채널 1은 DLG1 염색 또는 유사한 마커를 표시하고 채널 2는 BRP 염색을 표시하는 개별 TIFF 파일로 저장합니다. 먼저 NMJ 이미지 파일의 Z 투영 및 하이퍼스택을 만듭니다. 플러그인 옵션을 열고 Drosophila NMJ morphometrics를 선택합니다.
이제 현미경이 이미지 시리즈를 TIFF로 저장할 때 이미지 시리즈에 할당한 고유한 파일 문자열을 식별합니다. 이것은 이미지 이름의 끝에 있습니다. 가장 낮은 평면 및 채널 번호에 지정된 문자열을 복사하여 고유한 파일 문자열 설정 창에 붙여넣습니다. 그런 다음 하위 매크로 '스택으로 변환'을 선택하고 이미지가 있는 디렉토리 또는 폴더를 선택합니다.
각 이미지 파일에 대해 기본 이름인 stack과 flat stack, 그리고 원래 이미지 이름으로 두 개의 새 파일이 만들어집니다. 그런 다음 저장 공간을 절약하기 위해 원본 파일을 삭제할 수 있습니다. 다음으로, Drosophila NMJ morphometrics 인터페이스에서 정의된 ROI 하위 매크로를 선택하고 이미지 파일 디렉토리를 선택합니다.
첫 번째 투영이 열리면 자유형 선택 도구를 선택한 다음 마우스를 사용하여 관심 있는 완전한 NMJ 말단이 포함된 영역을 정의합니다. 선택되면 정의된 터미널 창에서 OK(확인)를 클릭합니다. NMJ 터미널이 모든 프로젝션에서 정의될 때까지 이 작업을 계속합니다. 매크로는 프로세스를 자동으로 진행합니다. 각 이미지 파일에 대해 기본 이름 ROI와 원래 이미지 이름으로 구성된 하나의 새 파일이 만들어집니다.
NMJ 기능을 정량화하려면 먼저 Drosophila NMJ 형태 측정 인터페이스로 이동하여 스케일을 설정합니다. 예를 들어, 이미지의 한 픽셀이 0.72미크론에 해당하는 경우 배율 픽셀을 1로 설정하고 배율 거리를 0.072로 설정합니다. 그런 다음 하위 매크로 Analyze(분석)를 선택하고 두 개의 채널 이미지가 있는 경우 Wait(대기)도 토글합니다. 확인을 누르고 메시지가 표시되면 이미지 파일 디렉토리를 선택합니다. 처리 시간은 시냅스당 몇 분이 될 수 있습니다.
분석 후 분석된 각 시냅스에 대한 새 이미지 파일은 부모 폴더에 저장되고 정량적 측정은 results.txt 파일에 있습니다. 모든 이미지를 검사하고 분할 오류가 있는 그림을 제외합니다.
예를 들어, 시냅스 말단의 일부는 노란색 윤곽선에 포함되지 않을 수 있습니다. 배경의 일부는 시냅스 말단에 포함될 수 있습니다. 파란색 골격선은 시냅스 말단 너머로 확장될 수 있습니다. 활성 영역이 너무 많거나 일부 활성 영역이 감지되지 않은 상태로 남아 있을 수 있습니다.
