합성 세포 응용을 위한 GUV(Giant Unilamellar Vesicles)의 무세포 반응

시작하려면 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 GUV 외부 완충 용액을 준비합니다. 스퍼미딘, ATP, GTP, CTP, UTP, 크레아틴 포스페이트, 마그네슘 아세테이트, 글루타민산 칼륨, HEPES, 수산화 칼륨, 폴린산. 포도당 및 아미노산 주식.

초순화된 탈이온수를 추가하여 용액의 최종 부피를 1밀리리터로 만듭니다. 다음으로, 흄 후드에서 17.3 마이크로리터의 POPC 스톡 용액을 15밀리리터 유리 바이알에 추가합니다. 이를 위해 1.08 마이크로 리터의 PEO-b-PBD 공중 합체를 피펫팅합니다.

유리 바이알에 아르곤 가스를 부드럽게 불어내면서 바이알을 회전시켜 클로로포름을 증발시킵니다. 그런 다음 1.2ml의 경질 미네랄 오일을 유리 바이알에 피펫팅합니다. 지질과 오일을 10-20초 동안 최대 속도로 소용돌이칩니다.

유리 바이알을 섭씨 50도의 오븐에 20분 동안 넣은 후 최대 속도로 10-20초 더 소용돌이칩니다. 다음으로, 270 마이크로 리터의 GUV 외부 용액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 피펫팅합니다. 이를 위해 5 몰의 염화나트륨과 4.5 몰의 염화칼륨을 각각 15 마이크로 리터로 피펫팅합니다.

GUV 외부 용액 위에 300마이크로리터의 지질과 오일 혼합물을 부드럽게 피펫팅합니다. 배양 후 용액 1-3, 용해성 sfGFP 또는 글루타메이트 수용체 sfGFP, murine RNAse 및 1몰 자당의 변이체에 대한 DNA 플라스미드 인코딩을 바이알에 피펫팅하여 CFE 반응을 조립합니다. 초순수 탈이온수를 추가하여 반응 부피를 20마이크로리터로 만듭니다.

600마이크로리터의 지질-오일 혼합물을 20마이크로리터 반응 혼합물이 들어 있는 마이크로원심분리기 튜브에 추가합니다. 반응을 유화시키기 위해 1분 동안 위아래로 세게 피펫팅합니다. 튜브의 오일 층 위에 내부 에멀젼을 부드럽게 덧붙입니다.

섭씨 4도에서 2000g으로 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 마이크로 원심분리기 튜브에서 여분의 오일과 외부 용액을 조심스럽게 피펫팅합니다. GUV 펠릿을 남은 용액에 부드럽게 혼합하여 재현탁시킵니다.

GUV 용액을 배양을 위해 깨끗한 96웰 투명하고 평평한 바닥 플레이트에 옮깁니다. 밀봉된 플레이트를 플레이트 리더에 옮겨 섭씨 37도에서 5-6시간 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 도립 컨포칼 현미경에 놓습니다.

GUV를 포함하는 관심 영역에 초점을 맞춘 다음 488나노미터의 여기 파장에서 이미지를 캡처합니다. 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다. 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.

Brightness/Contrast 설정 패널을 클릭하여 엽니다. 그런 다음 밝기와 대비를 조정하여 형광 단백질이 보이도록 합니다. GUV에 캡슐화된 야생형 글루타메이트 수용체 세포 무발현 반응은 우수한 발현 및 막 국소화를 보여주었습니다.

PRSP-글루타메이트 수용체는 응집과 반점 형성이 발생하기 쉬웠습니다. 용해성 sfGFP는 GUVS에서 발현되고 GUV 내강에 머물렀다.