성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 성체 근육 또는 배아에서 얻은 미세 절개 조직 임플란트에서 골격근 줄기 세포의 풍부한 집단을 분리하여 이들의 행동과 기능을 연구하는 것입니다. 이러한 세포는 치료 용도로도 사용될 수 있습니다. 이것은 먼저 무균 상태에서 성체 쥐 사체 또는 자궁 조직의 배아에서 표적 근육을 해부함으로써 달성됩니다.

절차의 두 번째 단계는 성인 근육 조직의 근육 조직을 세척 및 세척하고, 지방 및 결합 조직을 해부하고, 배아를 위해 새로운 DF 20 배지로 옮기는 것입니다. 외막과 내부 장기를 제거하고 새로운 DF 20으로 옮깁니다. 중간, 그런 다음 절개하여 근육이 풍부한 영역을 분리합니다.

절차의 세 번째 단계는 분리된 조직을 400마이크로미터 큐브로 미세 해부하는 것입니다. 96웰 플레이트의 중앙 60웰로 단독으로 옮기고 섭씨 37도에서 배양합니다. 절차의 마지막 단계는 셀에 점수를 매기는 것입니다.

세포는 몇 시간 또는 최대 2주 사이에 성공적인 x explant에서 나오기 시작하며, 조직 기원에 따라 explan 후에 생성됩니다. 궁극적으로, 성공적인 X explan 세포에서 출현하기 시작하는 세포가 확장될 수 있고 이후에 증식 및 세포사멸, 연구 및 단백질 마커 식별을 포함한 다양한 체외 및 생체 내 목적으로 사용될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 세포는 또한 클론 유래, 유전자 변형, 궁극적으로 재생 연구 또는 치료 응용 프로그램 테스트를 위해 숙주에 이식될 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 버밍엄 대학교 생명과학 대학의 골격근 줄기세포 생물학 연구실의 자넷 스미스입니다. 저는 자넷 스미스 연구실의 딘 라나이고, 역시 자넷 스미스 연구실의 바이런 첸입니다. 오늘은 성체 근육과 배아에서 얻은 Microdisect X 지방에서 골격근 줄기 세포 배양을 얻는 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 증식, 세포사멸 및 분화와 같은 골격근 줄기세포 거동을 연구하고 근이영양증과 같은 질병에서 비축근 줄기세포 기능을 연구합니다. 시작하겠습니다. 골격근에서 미세 이식 배양을 유도하는 기본 방법은 무균 조건에서 갓 추위에 떨어진 마우스의 표적 근육을 해부하는 것으로 시작됩니다.

이 시연에서는 뒷다리 근육을 절개하고 DF 20 배지를 두 번 갈아서 고립된 근육을 씻은 다음 60mm 접시에 담아 새로운 DF 20 배지에 넣습니다. 실체 해부 현미경을 사용하여 지방, 결합 조직 및 뼈를 배제하기 위해 멸균 상태에서 근육을 조심스럽게 미세 해부합니다. 다음으로, 청소한 근육 조각을 보석상의 집게를 사용하여 400마이크로미터 큐브 큐브로 자릅니다.

근육 조각을 개별적으로 DF 20당 50마이크로리터를 포함하는 96웰 플레이트의 중앙 60웰에 놓습니다. 엑스플랜을 포함하는 우물이 건조되는 것을 방지하기 위해 알타 우물에 식염수를 잘 채웁니다. 현미경으로 웰을 확인한 다음 96웰 플레이트를 섭씨 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다.

배양 24-48시간 후, 배양 후 48-72시간 간격으로 배양되는 근육의 성장 속도에 따라 마이크로 엑스플랜 부착 및 성장 점수를 매깁니다. 여기에 표시된 것은 ex explanted 성인 골격근에서 파생된 2일차 파생물과 응집된 배양과 높은 세포 밀도를 가진 확립된 ex explant 파생물의 예입니다. X explant는 각 개별 웰 내 세포의 합류 수준에 따라 점수가 매겨졌으며, 이는 나중에 SMS 세포의 확장 및 분리에 대해 입증될 것입니다.

Outgrowth 배양은 주로 SMS 세포 형태를 가진 세포, 응집 클러스터에서 성장하는 고굴절률을 가진 IE 구형 모노 핵 세포에 대해 개별적으로 모니터링해야 합니다. 자궁에서 E 12.5 배아를 해부하여 이 절차를 시작합니다. E 11.5 내지 E 17.5 단계 배아도 이러한 방식으로 해부할 수 있습니다.

상세한 미세 해부를 위해 PECM이 들어 있는 페트리 접시에 배아를 개별적으로 놓습니다. 그런 다음 개별 배아를 추가로 해부하여 골격근이 풍부한 영역을 분리합니다. 먼저 내부 장기를 제거하고 꼬리, 뒷다리, 낙하지, 상체 및 하체 벽을 해부합니다.

절개된 모든 조직을 새로운 PECM에 넣어 배아를 봉합합니다. Micro Explan 배양은 절개된 4개의 사지, 뒷다리, 상체 및 하체 벽을 미세 절개하여 동일한 크기의 조직의 작은 입방체를 생성합니다. 이 미세식물을 웰당 50마이크로리터의 PECM이 들어 있는 96웰 플레이트의 중앙 60웰에 개별적으로 배치합니다.

배아 배양을 위해 연구된 배아당 웰당 하나의 x 식물을 포함하는 최소 60개의 웰이 설정되어야 합니다. 중앙 60 개의 우물은 계획이 파생 된 곳을 나타내는 영역으로 세분화 될 수 있습니다. 이 설계는 각각 사지, 상체 벽, 뒷다리 및 하체 벽을 각각 포함하는 15개의 웰을 허용합니다.

Explan은 섭씨 37도에서 3주 동안 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 3주간의 배양 기간 동안 explan은 도립 현미경을 사용하여 배양 3일, 7일, 14일, 21일에 점수를 매깁니다. Explan은 각 개인의 세포가 합류하는 정도에 따라 점수가 매겨집니다. 잘.

이 예는 신화 5 0 - 14%15 - 24%25 - 49%50 - 74%및 75 - 100%로 염색된 E 15.5 1차 배아 엑스플랜 배양물의 다양한 수준의 합류를 보여주며, SMS 세포의 형태학적 특징을 나타내는 COFLUENT X 엑스플랜 배양이 하위배양이 될 수 있으면 배양의 사진 이미지도 촬영할 수 있습니다. 선택한 웰에서 배양 배지를 제거하고 0.2마이크로미터 ACR 디스크를 사용하여 여과합니다. R 주사기 필터를 사용합니다.

사용을 위해 매체를 보관하십시오. 글쎄, PECM에 1-10으로 희석 된 디스크 100 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 20분 동안 다시 넣습니다.

20분 후, 피펫 팁을 사용하여 웰 표면에서 느슨해진 세포를 부드럽게 긁어낸 다음 3분 동안 중력의 1000배에서 세포 현탁액을 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 세포는 resusus에 의해 희석되어 2ml의 PECM에 현탁시킨 다음 새로운 48웰 플레이트의 웰로 이동합니다. 마지막으로 추가 확장을 위해 세포 혼합물을 48웰 플레이트로 옮깁니다.

분석을 위해 세포를 준비하기 위해 플레이트 디스플레이 하위배양, PECM에서 1차 배아 Splunk 배양 및 커버 슬립에 조건화된 배지 48. 웰 플레이트(Well plates) 세포는 세포가 부착될 수 있도록 섭씨 37도의 3cm 정사각형 인큐베이터에 10배의 밀도로 도금되며, 세포사멸 및 증식을 평가하는 데 일반적으로 4-6시간이 걸립니다. 커버의 세포를 세척하고 PBS에서 두 번 미끄러지며 실온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 고정 후 PBS로 10 분 동안 커버를 미끄러 뜨린 다음 3 분 동안 DPI 밀리리터당 10 마이크로 그램으로 염색합니다.

접시를 호일로 감싸고 PBS에서 5-10분 동안 한 번 미끄러집니다. 그 후, 우물에서 덮개 슬립을 제거하고 daco cyto nation의 한 자리에 뒤집습니다. 유리 슬라이드에 매체를 장착하고 덮개의 가장자리를 밀봉하고 보관을 위해 네일 바니시로 미끄러집니다.

슬라이드를 호일로 싸서 계산을 위해 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 슬라이드는 정립 현미경에서 형광 하에서 볼 수 있으며 IP grae를 사용하여 세포사멸 및 유사분열 세포에 대한 점수를 매깁니다. 엑스플란이 성체 골격근 또는 배아에서 조심스럽게 이식되면 섭씨 37도에서 배양 후 몇 시간에서 72시간 이내에 세포를 생성하기 시작합니다.

세포 집단의 확장은 출처에 따라 배아 임플란트의 경우 며칠에 걸쳐 발생하며, 오래된 골격근 임플란트의 경우 몇 주에 걸쳐 발생하여 SMS 세포의 성공적인 클론 유도의 대표적인 결과인 SMS 세포 1차 배양을 생성합니다. 96웰 플레이트(96 well plate)로 분리된 단일 세포는 단일 세포 기원의 군체(colony)가 되어 결국 확립된 클론 집단(clonal population)을 초래합니다. 이후 MIF 5 면역조직화학을 사용하여 SMS 세포 식별을 확인합니다.

골격근에서 유래한 성체 줄기세포를 숙주 마우스의 경골 전방근에 이식하고, 이 세포는 베타 GC 라벨링에 의해 식별되며, 주사 후 3개월에 촬영된 이 이미지에서 파란색으로 염색된 최근에 융합된 베타 갈락토 양성 세포 3개가 주사 후 14개월에 근육 섬유에서 관찰되며, 근육 섬유에서 BTIC 갈락토 양성 세포의 광범위한 기여는 갈색으로 염색된 항 베타 갈락토 항체에 의해 검출됩니다. 베타 갈락토 양성 위성 세포는 이 이미지에서 화살표로 표시됩니다. 주사 후 12개월 동안 주입된 숙주 근육에서 분리할 때 1차 항체가 사용되지 않은 대조군에는 염색이 없습니다.

베타 갈락토 양성 세포는 마우스 클론 SMS 세포주의 증식 배양 핵형 분석은 PD 5 개의 제로 A 세포 군체에서 정상적인 이배체 염색체 보체 베타 갈락토 발현을 보여줍니다 dystrophic 배아 신화의 체외 내 분석 5 개의 양성 근 아세포는 이러한 근 아세포가 과도하게 증식하고 세포 사멸이 발생하기 쉽다는 것을 보여줍니다. Muscle X explan 배양에서 배아 근아세포의 outgrowth rate는 야생형 X explan과 비교할 때 MDX 및 CAV 3 녹아웃 돌연변이 모두에서 증가합니다. MIF 5 immuno stained explan의 예가 여기에 나와 있습니다. 배아 근아세포의 과다 증식은 KI 67 양성 면역 반응에 의해 결정된 바와 같이 이러한 MDX 및 CAV 3개의 녹아웃 돌연변이에서 관찰됩니다.

또한, DPI 염색에서 볼 수 있듯이 이러한 두 돌연변이에서 상승된 세포사멸이 발생하며, 이 이미지는 화살표로 표시된 세포사멸세포의 예를 보여줍니다. 방금 성인으로부터 골격근 줄기세포를 분리하고 배아를 미세절부하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 미세 절개 이식의 크기에 주의해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

너무 크면 까마귀가 나오고 세포가 죽습니다. 너무 작으면 지원하지 않습니다. 매출의 좋은 성장.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.