TALEN 매개 표적 유전자 통합: 형광 단백질 유전자를 hiPSC에 정밀하게 삽입하기 위해 엔지니어링된 염기서열 특이적 뉴클레아제 사용

인간 유도 만능 줄기세포 또는 배지 내 hiPSC 현탁액으로 시작합니다. 한 쌍의 transcription activator-like effector nuclease 또는 TALEN 인코딩 플라스미드를 추가합니다. 항생제 내성 유전자와 결합된 형광 단백질 유전자를 지닌 공여 플라스미드를 보충하며, 표적 유전자좌에 대한 특이적 정렬을 위해 인접한 상동성 암을 갖습니다.

혼합물을 전기천공하여 세포막에 일시적인 공극을 생성하여 플라스미드 내재화를 가능하게 합니다. 세포 내부에서는 TALEN 인코딩 플라스미드가 처리되어 비특이적 FokI 제한 엔도뉴클레아제 절단 도메인과 융합된 부위 특이적 TALE DNA 결합 도메인으로 구성된 키메라 단백질인 TALEN을 생성합니다.

탠덤 아미노산 반복 모듈로 구성된 DNA 결합 도메인을 통한 각 TALEN 단량체는 스페이서 염기서열로 분리된 반대 방향의 각 DNA 가닥에서 뉴클레오타이드당 하나의 모듈인 표적 유전자좌를 인식하고 결합합니다. 그런 다음 FokI 도메인은 스페이서 염기서열 내에서 DNA를 이합체화하고 절단하여 돌출부가 있는 이중 가닥 절단을 생성합니다.

절단된 부위 옆에 있는 영역을 보완하는 상동성 암을 포함하는 donor plasmid가 있는 경우, 상동성 염기서열을 DNA 복구 합성을 위한 주형으로 사용하여 이중 가닥 절단을 연결하는 상동성 지향 복구가 발생합니다. 흠집의 결찰 후, 중간에 있는 형광 단백질과 항생제 내성 유전자가 숙주 게놈에 통합됩니다.

성장을 지원하기 위해 공급세포층에 파종된 hiPSC를 항생제 함유 배지로 치료합니다. 업스트림 내인성 프로모터에 의해 구동되는 promoter-less 항생제 내성 유전자는 TALEN 편집 세포의 선택을 용이하게 합니다.