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DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯
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Transcript
DNA 메틸화는 DNA의 시토신 염기에 메틸기를 추가하여 5-메틸시토신을 형성하는 후성유전학적 변형입니다. 이 변형은 유전자 발현을 변경합니다.
도트 블롯을 통한 DNA 메틸화를 정량화하려면 다양한 수준의 메틸화된 시토신을 나타내는 다양한 탈분화 단계에서 인간 연골 세포에서 유래한 게놈 DNA 샘플을 채취합니다.
DNA 샘플을 강알칼리인 수산화나트륨으로 처리하고 가열합니다. 이 처리는 두 DNA 가닥 사이의 수소 결합을 끊어 DNA 변성을 일으킵니다. 아세트산 암모늄을 첨가하여 알칼리를 중화시켜 과도한 DNA 분해를 방지합니다.
나일론 멤브레인을 가져와서 변성된 DNA 샘플을 점으로 찾아냅니다. 음전하를 띤 DNA는 정전기 상호작용을 통해 양전하를 띤 나일론 멤브레인에 결합하여 고체 지지체에 얼룩을
남깁니다.블로트된 멤브레인을 블로킹 버퍼로 처리하여 비특이적 결합을 방지합니다. 다음으로, 멤브레인에 항-5-메틸시토신 항체를 추가하고 배양합니다. 이 항체는 DNA의 메틸화된 시토신(cytosine)에만 독점적으로 결합합니다.
세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 1차 항체에 특이적으로 결합하는 화학발광 효소 접합 2차 항체를 추가합니다.
멤브레인에 화학발광 기질을 추가합니다. 항체의 효소는 기질과 반응하여 화학발광을 생성하여 다양한 강도의 점을 생성합니다.
멤브레인을 이미지화하고 각 샘플의 DNA 메틸화 정도에 해당하는 점의 강도를 측정합니다.
