조직 용해물에서 표적 단백질을 추정하기 위한 정량적 점 블롯

정량적 도트 블롯(QDB)은 시료 내 표적 단백질의 농도를 정량화하는 데 유용한 기술입니다. 샘플이 고분자 멤브레인에 고정되면 면역 블로팅을 통해 단백질을 검출할 수 있습니다.

시작하려면 각 웰의 바닥에 니트로셀룰로오스 멤브레인이 부착된 다중 웰 플레이트인 QDB 플레이트를 예로 들어 보겠습니다. 표적 단백질을 포함하는 조직 용해물인 샘플을 웰 내부의 멤브레인 중앙에 추가합니다.

샘플을 말리십시오. 표적 단백질은 비공유 상호작용을 통해 막에 결합합니다.

차단 솔루션을 추가합니다. 용액의 단백질은 멤브레인의 결합되지 않은 부위에 부착되어 검출 시약의 비특이적 결합을 방지합니다.

다음으로, 샘플의 표적 단백질에 결합하는 1차 항체가 포함된 용액을 추가합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하려면 세척하십시오.

그런 다음 2차 항체 용액을 추가합니다. 과산화효소(peroxidase enzyme)로 표지된 이 분자는 단백질 결합 1차 항체에 결합합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하려면 세척하십시오.

마지막으로 화학발광 기질과 과산화수소를 포함하는 용액을 추가합니다. 과산화수소를 사용하여 항체 결합 과산화효소는 기질을 산화시키고 빛을 방출합니다. 플레이트 리더를 사용하여 샘플의 발광 강도를 측정합니다.

표적 단백질의 알려진 농도를 가진 연속 희석을 사용하여 표준 발광 곡선을 생성합니다. 측정된 샘플의 발광 값을 곡선에 표시하여 목표 단백질 농도를 결정합니다.