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단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)
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Transcript
총 단백질 정규화 기반 기술인 정량적 웨스턴 블로팅(western blotting)은 표적 단백질 발현 수준을 정량화하는 데 유용합니다.
시작하려면 조직 용해물을 폴리아크릴아미드 구배 겔의 웰에 로드합니다. 용해물에는 다른 세포 단백질과 함께 표적 단백질이 포함되어 있습니다.
그래디언트를 따라 샘플 단백질의 전기영동 분리를 위해 적절한 전압에서 겔을 실행합니다. 완료되면 전사 스택의 고분자 멤브레인 위에 겔을 놓습니다.
분리된 단백질을 멤브레인으로 전달하기 위해 전류를 가합니다. 다음으로, 멤브레인을 형광 총 단백질 염색에 놓습니다. 염색 물질의 하전된 염료 분자는 멤브레인의 모든 단백질에 정전기로 결합합니다.
차단 솔루션을 추가합니다. 용액의 단백질은 멤브레인에 결합합니다. 검출 시약의 비특이적 결합을 방지합니다. 표적 단백질에만 1차 항체 결합을 추가합니다. 그런 다음 1차 항체에 부착되는 형광단으로 표시된 2차 항체를 추가합니다.
레이저로 샘플을 여기시킵니다. total protein stain의 염료 분자와 해당 파장에서 항체 결합 형광단에서 방출된 형광을 기록합니다.
정규화된 단백질 로딩 값을 계산하려면 각 레인의 총 단백질 신호를 가장 높은 값으로 나눕니다. 타겟 단백질 신호를 해당 정규화된 로딩 값으로 나누어 타겟 단백질의 상대적 발현을 결정합니다.
