마우스 배아 줄기 세포 게놈에서 상동 재조합을 검출하기 위한 서던 블로팅(Southern Blotting)

서던 블로팅(Southern blotting)은 프로브 기반 검출을 통해 복잡한 DNA 믹스에서 특정 DNA 염기서열을 식별하는 것을 포함합니다.

서던 블로팅(Southern blotting)이 있는 마우스 배아 줄기 세포에서 상동 재조합 또는 HR 이벤트를 식별하려면 세포에서 게놈 DNA를 얻습니다. 제한 효소로 배양하여 DNA를 더 작은 조각으로 소화합니다.

DNA를 아가로스 겔에 로드합니다. 크기 기반 단편 분리를 위한 전기영동을 수행합니다.

산성 용액으로 겔을 처리하여 퓨린 염기를 제거하고 이중 가닥 DNA, dsDNA를 느슨하게 합니다. 알칼리성 변성 용액을 첨가하십시오. 높은 pH는 수소 결합을 파괴하여 느슨해진 dsDNA를 단일 가닥 DNA, ssDNA로 변성시킵니다. 겔 pH를 중화하기 위해 중화 용액으로 배양합니다.

블로팅 페이퍼, 나일론 멤브레인 및 멤브레인 위에 쌓인 젤을 사용하여 전사 시스템을 조립합니다. 전송을 수행합니다. ssDNA는 하향 모세관 작용을 통해 겔에서 멤브레인으로 전달됩니다.

멤브레인에 자외선을 조사하여 DNA를 가교하고 고정시킵니다. 혼성화 용액이 들어 있는 튜브에 멤브레인을 놓습니다. 회전으로 배양하여 멤브레인을 코팅하고 비특이적 프로브 결합을 방지합니다.

마지막으로, 단일 가닥 방사성 표지 프로브를 포함하는 혼성화 완충액으로 멤브레인을 배양합니다. 프로브는 염기서열 상보성을 통해 특정 DNA 영역에 결합합니다.

멤브레인을 세척하여 결합되지 않은 프로브를 제거합니다. 멤브레인을 X선에 노출시킵니다. 멤브레인의 뚜렷한 띠는 HR 이벤트를 포함하는 DNA 영역과 대조 영역을 구별합니다.