여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사
2007년 7월 4일
역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 뎅그열 바이러스를 항구 여성 A. aegypti 모기로 dsRNA를 주입하기 위해 제임스 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , 주사 바늘을 보정 사출 설정을 조작하고, 흉부에 dsRNA를 주입에 대한 기술은 그림이다.
안녕하세요, 제 이름은 브라이언 루나입니다. 저는 오늘 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 제임스 랩(James Lab)에 계십니다. 오늘 저는 성인 80 년대 gyp 유형 여성 모기에 이중 strated, RNA 주입에 대해 이야기 할 것입니다.
따라서 절차는 수동 설정을 사용하고 성인 여성을 흉부에 주입하는 것으로 구성됩니다. 이중 연선. RNA 주입은 우리 실험실에서 수많은 유전자를 녹다운하는 데 사용할 수 있습니다. 구체적으로 말하자면, 우리는 스테로이드 생합성과 관련된 유전자를 무너뜨리기 위해 이를 사용하고 있습니다.
이제 바늘 준비에 대해 이야기 할 것입니다. 이제 저는 이 망아지 규산염 유리 모세관 튜브를 사용하여 바늘을 준비합니다. 이제 이 모세혈관을 Sutter 마이크로 사출 풀러에서 당겨지고 바늘을 당긴 후 다음 단계는 물을 사용하여 바늘을 보정하는 것입니다.
이 프로세스의 다음 단계는 바늘을 보정하는 것입니다. 따라서 Sutter Polar에서 바늘을 뽑으면 다음과 같이 보이기 때문에 최종 제품에는 바늘에 검은색 샤피 마커가 명확하게 표시됩니다. 이제 표시를 표준화하기 위해 각 바늘에는 마이크로 피펫터에 의해 설정된 부피가 로드됩니다.
바늘의 보정은 중요하며, 그렇지 않으면 각 모기에 주입하는 정확한 농도나 양을 알 수 없습니다. 이 시연을 위해 모세관 튜브에 식용 색소 염료를 넣었습니다. 일반적인 이중 가닥 RNA 현탁액 대신 이중선 좌초된 RNA는 바늘을 용액에 삽입하여 바늘에 로드할 수 있으며 모세관 작용이 떨어지고 유체가 떨어집니다.
이제 주입 설정에 대해 이야기 해 드리겠습니다. 50ml 주사기, 고무 호스에 부착된 스톡 콕 어셈블리 및 유리 모세관 어댑터로 구성됩니다. 스톡 콕 어셈블리는 세 가지 개별 위치로 조정할 수 있습니다.
이 첫 번째 위치가 휴식 위치입니다. 두 번째 위치는 주입 위치에 있고 세 번째 위치는 주사기에 공기를 채우는 데 사용되며 주입을 위한 압력을 형성하기 위한 압력으로 사용됩니다. 따라서 주사를 맞히는 동안 모기는 잠을 잘 수 있도록 얼음 위에 보관됩니다.
주사 후 가장 좋은 방법은 생존율을 높이기 위해 실온에 다시 두는 것입니다. 그래서 이것은 이와 같은 또는 일반 컵과 천 마이크로 리터 피펫을 사용하여 수행됩니다. 피펫의 끝을 잘라 컵에 넣으면 최종 제품이 다음과 같습니다.
컵 위에는 메쉬 그물과 뚜껑 덮개를 놓습니다. 그리고 이제 이것은 공기가 컵 안팎으로 이동할 수 있게 하고 일부 모기가 날아가는 것을 막습니다. 컵에 삽입된 피펫 팁에서 모기가 날아가지 않습니다.
이제 주사를 맞을 준비가 거의 다 되었습니다. 이중 가닥 RNA로. 다음 단계는 CO2를 사용하여 모기를 마취하고 모기를 얼음 위에 올려 놓고 잠을 자게 하는 것입니다.
이제 우리는 실제로 모기를 잡을 준비가 되었습니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 주사기를 채우고 공기를 채우는 것입니다. 이 작업이 완료되면 밸브가 정지 위치로 조정됩니다.
그래서 여기 모기의 흉부에 바늘을 삽입하려고합니다. 이 프로세스의 다음 단계는 밸브를 사출 위치로 회전시키고 원하는 양의 부피를 주입하는 것입니다. 그리고 주입이 완료되면 모기를 컵에 다시 넣습니다.
나는 방금 성인 80 년대 gti에 RNA의 이중 가닥을 주입하는 기술을 보여 드리는 것을 마쳤습니다. 모기 넉다운은 R-T-P-C-R 또는 정량적 R-T-P-C-R을 사용하여 결정할 수 있습니다. R-T-P-C-R을 사용하여 관심 있는 g의 특정 시점에 대한 녹다운 효율성을 결정할 것입니다.
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개요
이 비디오 프로토콜은 뎅기 바이러스의 벡터인 암컷 에이데스 애기타 모기에 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 주사하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 벡터 병원체에 대한 저항성과 관련된 유전자 기능을 연구하는 데 매우 중요합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전학
- 벡터 생물학
배경
- 역전 유전학 접근법은 병원체 저항성과 관련된 유전자를 식별하는 데 도움이 됩니다.
- 에이데스 애기타 모기는 뎅기열과 같은 질병의 중요한 벡터입니다.
- 이중 가닥 RNA 주사는 특정 유전자를 억제할 수 있습니다.
- 이 방법은 성충 모기에서 표적 유전자 조작이 가능합니다.
연구 목적
- 모기에 dsRNA를 주사하는 기술을 설명합니다.
- 스테로이드 생합성과 관련된 유전자 기능을 탐구합니다.
- 병원체에 대한 모기 저항성에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- dsRNA 주사를 위한 수동 설정.
- 성충 암컷 모기의 흉부에 dsRNA 주사.
- 정밀도를 위한 주사 바늘 캘리브레이션.
- 효과적인 전달을 위한 주사 설정 조작.
주요 결과
- 에이데스 애기타 모기에 dsRNA 주사에 성공했습니다.
- 스테로이드 생합성과 관련된 유전자의 억제를 관찰했습니다.
- 주사 기술의 실현 가능성을 입증했습니다.
- 벡터 제어 전략에 대한 잠재적 영향이 있습니다.
결론
- dsRNA 주사 방법은 모기에서 유전자 조작에 효과적입니다.
- 이 기술은 모기 생물학 및 질병 저항성 이해를 돕는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 향후 연구는 이 방법을 바탕으로 추가 유전자를 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional gene knockdown in adult female Aedes aegypti mosquitoes, supporting target validation in vector biology. By allowing precise dsRNA delivery to the thorax, it facilitates mechanistic de-risking of genes involved in pathogen resistance and steroid biosynthesis. The method provides a scalable approach for phenotypic screening in disease-relevant insect models, informing early discovery decisions for vector control strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by knocking down genes related to steroid biosynthesis and pathogen resistance.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation in adult mosquito models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay standardization through calibrated needle injection and quantitative readouts via RT-PCR.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound or genetic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system for studying vector-pathogen interactions and resistance mechanisms.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by linking gene knockdown to phenotypic outcomes in pathogen susceptibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic validation, enabling iterative refinement of vector control targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through targeted gene knockdown in adult mosquitoes.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized injection volumes and measurable knockdown efficiency.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., gene expression via RT-PCR) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling gene function in a disease-relevant insect vector.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene screening across multiple targets in vector biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through measurable gene knockdown and phenotypic assessment.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of dsRNA delivery across mosquito cohorts.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in target prioritization by reducing mechanistic ambiguity in resistance pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement decisions based on functional validation of genes in pathogen susceptibility.
Implementation Considerations
- Expertise in mosquito handling, microinjection, and molecular biology techniques.
- Instrumentation including microinjection puller, syringe setup, and calibration tools.
- Cross-team standardization of needle calibration and injection protocols.
- Adaptation considerations for different mosquito species or developmental stages.
- Practical limitations include mosquito survivability post-injection and variability in dsRNA delivery efficiency.
