공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

본 논문은 성장의 다른 방법을 설명합니다

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 인간 기도 상피 세포의 정점 표면에서 슈도모나스 에어로겐 생물막을 성장시키는 것입니다. 이것은 먼저 플라스틱 표면 또는 유리 커버 슬립에 기도 상피 세포의 합류 단층을 구축함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 녹색 형광 단백질을 발현하는 p 에어로겐 박테리아의 배양을 구성적으로 성장시키는 것입니다.

다음 단계는 박테리아와 기도 세포를 정적 환경 또는 유동 챔버에서 서로 접촉하도록 배치하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 기도 세포의 생존력을 평가하면서 시간이 지남에 따라 박테리아 생물막이 발생하도록 하는 것입니다. 형광 현미경 검사를 통해 살아있는 기도 세포의 생물막 형성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술의 의미는 낭포성 섬유증 환자의 치료로 확장되는데, 그 이유는 이러한 공동 배양 모델을 사용하여 새로운 항생제 요법을 개발하고 검증할 수 있으며, 기도의 만성 집락화를 담당하는 생물막을 근절할 수 있기 때문입니다. 낭포성 섬유증 환자에서 정적 공동 배양 생물막 모델은 불멸의 인간 기도인 CFBE 세포를 사용합니다. 상피 세포는 원래 세균 접종 7-10일 전에 낭포성 섬유증을 앓고 있는 개인으로부터 발달했으며, 24웰 조직 배양 플레이트에 CFBE 세포를 파종했습니다.

우리는 10% 소 태아 혈청 2밀리리터, 페니실린 및 밀리리터당 50마이크로그램으로 보충된 0.5밀리리터의 최소 필수 배지 또는 MEM에 웰당 10배에서 5번째 세포의 2배 농도로 세포를 파종합니다. 스트렙토마이신은 섭씨 37도에서 세포를 성장시키고 이산화탄소는 5%입니다. 95%7-10일 동안 공기는 2-3일마다 매체를 바꿉니다.

이러한 조건은 실험 하루 전에 합류점, 단층 및 밀접 접합부의 형성으로 이어질 것입니다. 냉동 스톡에서 추출한 피에로 겐으로 5ml LB 배양액을 접종하고 회전체에서 섭씨 37도에서 18시간 동안 성장합니다. 200 RPM에서 우리는 박테리아 접종 당일 GFP의 구조적 발현을 위해 PSMC 21 플라스미드를 운반하는 p 에어로겐을 사용합니다.

CFPE 세포에서 배지를 제거하고 2 밀리몰 L-글루타민 접종 합류점, 원래 24 웰 플레이트에 파종된 CFBE 세포의 수에 비해 약 30 대 1의 감염 다중성에서 포사를 가진 CFBE 단층으로 보충된 페놀 레드가 없는 MEM인 동일한 부피의 현미경 배지를 추가합니다. 이는 MEM당 0.5밀리리터에서 밀리리터당 7번째 CFU의 1.2 곱하기 10에 해당합니다. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 공기 95%에서 1시간 동안 잘 배양합니다.

1시간 배양 후 스내트를 제거하고 새로운 현미경으로 교체하십시오. 배지에는 0.4%아르기닌이 보충되어 있습니다. 아르기닌의 첨가는 CFPE 세포에 생물막이 형성될 만큼 충분히 오랫동안 단층의 파괴를 지연시킵니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 공기 95%에서 최대 2시간마다 약 8시간까지 다양한 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경을 사용하여 CFBE 단층의 무결성과 생물막의 성장을 분석합니다. 플로우 셀 공동 배양 생물막 모델은 40mm 직경의 유리 커버 슬립에 CFBE 세포의 합류 단층을 형성해야 합니다.

이를 위해 먼저 멸균 덮개를 직경 60mm의 멸균 플라스틱 접시에 넣습니다. 그런 다음 3ml의 예열 세포 성장을 추가하고 피펫 끝으로 커버 슬립을 중간 눌러 아래에 갇힌 기포를 제거하고 커버 슬립을 플라스틱 접시 씨앗의 바닥으로 밀어 넣으십시오. 접시 당 10에서 6 번째 CFBE 세포의 2 배. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들되 세포가 접시 측면에 원심분리되는 것을 방지하기 위해 소용

접시를 5% 이산화탄소, 95% 공기 인큐베이터에 섭씨 37도의 8-10일 동안 놓습니다. 격일로 3ml의 신선한 성장 배지를 세포에 공급하십시오. 이러한 조건에서 세포는 유리 커버 슬립에 합류 단층을 형성합니다.

다음 단계는 실험 하루 전에 P 에어로겐 박테리아 균주를 준비하는 것입니다. 회전체에서 섭씨 37도에서 18시간 동안 5ml의 LB에서 p 에어로겐을 성장시킵니다. 200 RPM에서 실험 당일 GFP의 구성적 발현을 위해 PSM C 21 플라스미드를 운반하는 P 에어로겐 균주, PO one을 사용합니다.

1 밀리리터의 박테리아 배양액을 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 6, 000 RPM에서 3 분 동안 원심 분리기를 사용합니다. 박테리아 펠릿을 1ml의 현미경으로 두 번 세척합니다. 중간 농도: 0.5ml의 세척 및 재현탁 박테리아를 4.5ml의 현미경 배지에 희석하여 밀리리터당 8번째 CFU의 약 5배의 농도를 달성합니다.

이제 CFPE 세포를 실시간으로 관찰할 준비가 되었으며, 이를 위해서는 장시간 동안 영양소의 흐름을 보장하기 위해 연동 펌프에 연결된 이미징 챔버가 필요합니다. 그리고 온도 조절기는 표준 생물막 플로우 셀 장치를 사용합니다. 생명공학 FCS 2 챔버는 CFPE 세포를 수용하도록 변형되었습니다.

플로우 셀 공동 배양 생물막 모델에서 가장 중요한 단계 중 하나는 세포 모니터를 손상시키지 않고 챔버를 조립하여 챔버를 조립하는 것입니다. 관류 튜브가 보이도록 챔버의 위쪽 절반을 거꾸로 잡고 0.75mm 두께의 고무 개스킷의 여유 구멍을 관류 튜브에 맞춥니다. 챔버와 함께 제공된 마이크로 수로 슬라이드를 고무 개스킷 위에 쌓고 홈이 있는 면이 위로 향하도록 합니다.

그런 다음 슬라이드 위에 다른 고무 개스킷을 놓습니다. 이 두 번째 개스킷의 두께와 내부 형상은 챔버의 부피를 결정합니다. 다음으로, 슬라이드 중앙에 1ml의 예열 현미경 매체를 추가합니다.

Cell Culture Incubator에서 CFPE 세포를 회수하는 동안 이미징 챔버를 멸균 표면에 놓습니다. 접시에서 사용한 배지를 제거하고 3ml의 예열 현미경 배지로 CFPE 세포를 한 번 세척합니다. 에탄올 세척 겸자 사용.

접시에서 커버 슬립을 꺼내 챔버에 놓인 현미경 매체의 비드 위에 거꾸로 내립니다. 커버 슬립은 이제 두 번째 고무 개스킷에 놓이고 기도 세포의 단층은 아래를 향하고 있습니다. 조립된 구성 요소를 한 손으로 잡고 챔버 바닥을 스택 위에 놓고 모든 것이 올바른 면이 위로 향하도록 챔버를 신속하게 뒤집습니다.

링을 돌려 베이스를 제자리에 잠급니다. 입구 튜브를 저유량 마이크로 관류 펌프에 연결합니다. 두 번째 튜브 조각은 펌프를 섭씨 37도의 수조에 배치된 현미경 매체 플라스에 연결합니다.

현미경 바로 옆에 있습니다. 시간당 20밀리리터의 속도로 흐름을 시작하십시오. 이 유속은 posa의 수영 속도 능력 내에 있습니다.

미리 절단된 멸균 16번째 CFL 튜브 하나를 챔버의 입구 및 출구 관류 튜브에 부착한 다음 온도 컨트롤러를 연결합니다. 조립된 챔버를 도립 형광 현미경의 현미경 스테이지에 놓습니다. 1밀리리터 일회용 주사기를 사용합니다.

펌프와 챔버 사이에 일렬로 배치된 양방향 밸브를 사용하여 미리 준비된 박테리아 현탁액을 챔버에 주입하여 박테리아가 기도 세포에 부착할 수 있도록 합니다. 2시간 동안 펌프를 멈춥니다. 2시간 후 유량이 다시 시작되고 시간당 20밀리리터로 유지될 수 있습니다.

나머지 실험에서는 차등 간섭을 통해 기도 세포의 무결성을 모니터링합니다. 실험 전반에 걸쳐 현미경을 대조하여 단층의 손상 징후를 확인합니다. 동시에 기도 세포의 정점 표면에서 GFP 표지 p 에어로겐 생물막의 발달을 따릅니다.

정적 분석과 플로우 셀 분석 모두에서 도립 컨포칼 또는 광시야 형광 현미경으로 이미지를 획득함으로써 CFPE 단층이 접종 후 최대 8시간 동안 어떠한 변화의 징후 없이 p aerogen의 존재를 견딜 수 있는 것으로 나타났습니다. 상피 단층 무결성은 조직 배양 플레이트에서 성장한 CFPE 세포의 융합 단층의 예에서 볼 수 있듯이 반전을 사용하여 위상차 현미경으로 평가할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 p 에어로겐은 상피 세포 단층을 완전히 또는 절편으로 손상시킬 수 있는 독소와 독성 인자를 생성합니다.

손상된 CFPE 단층의 이 예에서 녹색으로 표시된 P 에어로겐 박테리아는 상피 세포의 밀접한 접합부 사이에서 퍼져 기저외막에 접근하는 것을 볼 수 있습니다. 생물막 형성은 일반적으로 단층의 열화로 인해 이러한 조건에서 달성되지 않습니다. 이 이미지는 생물막 형성을 성공적으로 지원한 후 접종 후 24시간 후에 관찰된 과도하게 자란 p 에어로겐 생물막을 보여줍니다.

CFPE 단층은 수리할 수 없을 정도로 손상되어 현재 거의 없습니다. 박테리아의 평평한 층으로 성장하는 잔류 생물막이 유리 커버 슬립에 부착되어 있는 것으로 표시됩니다. 기도 단층의 무결성이 손상되지 않은 경우.

P 에어로겐 생물막은 두 공동 배양 모델 모두에서 기도 세포의 정점 표면에서 성공적으로 형성되고 발달할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 에피 형광 현미경으로 평가된 정적 공동 배양 생물막 모델을 사용하여 CFPE 세포의 합류 단층에 성장한 p 에어로겐 생물막을 발현하는 A GFP의 대표적인 이미지입니다. 이미지는 얼굴 대비 채널과 형광 채널의 오버레이입니다.

다음 이미지는 P aerogen으로 표시된 A GFP를 보여줍니다. 기도의 시각화를 용이하게 하기 위해 플로우 셀 공동 배양 생물막 모델을 사용하여 CFBE 세포의 합류 단층에서 6시간 동안 성장한 생물막. 단층핵은 posa를 접종하기 전에 HEXT 3, 33, 42로 염색하고 파란색으로 나타납니다.

CFPE 세포의 정점 표면에 부착된 녹색 덩어리로 나타나는 필름은 기도 세포를 가로질러 분산됩니다. 3D 재구성 후 A-C-F-P-E 세포 단층에 형성되는 6시간 된 에어로겐 생물막의 전형적인 버섯 같은 구조가 여기에 나와 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여기에 설명된 공동 배양 모델을 사용하여 확립된 기도 세포에서 박테리아 생물막을 성공적으로 성장시키고 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 표준 미생물 분석법 및 형광 현미경 검사와 결합해야 합니다.