서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

광학 이미징과 유전적으로 암호화된 독감 바이러스의 획기적인 발전으로 과학자들은 살아있는 생물과 어떤 경우에는 행동하는 유기체에서도 관심 있는 생물학적 과정을 연구할 수 있게 되었습니다. 생체 내에서 포유류의 뇌를 연구하는 데 많은 중점을 두었지만, 우리 실험실은 영양 신경근 접합부라는 다소 간단한 모델 시스템을 사용하며 다음 비디오에서는 시간과 시간에 걸쳐 개별 시냅스의 발달을 따르기 위해 과일 시험 유충을 마취하고 이미지화하는 방법을 설명합니다. 음식의 발달을 연구하는 방법으로 며칠까지. Avi가 존재하며, 제시될 예정이며 중단 프로토콜은 다음과 같은 주요 기능을 특징으로 합니다.

우선, 매우 높은 수준의 분석에 의해 심장 박동조차도 정지되며, 이는 높은 이미지 품질에 필수적입니다. 둘째, 95%의 생존율과 매우 민감한 이미지를 획득할 수 있는 능력입니다. 뒤에 오는 프로토콜은, 예를 들면, 저희를 GFP로 표기되고 그들의 내인성 프로모터에 의해 생리적인 수준에 표현되는 글루타메이트 수용체의 역학을 공부하는 것을 허용합니다.

이제 이미징 챔버에 유충을 삽입하는 방법, 유충을 위해 과일을 마취하는 방법, 등록 계단을 이미지화하기 위해 유충 내에서 특정 위치를 찾는 방법, 그리고 유충을 이미징에서 복구하는 방법을 배우게 됩니다. 생체 내 이미징 전에 유충을 세척하는 것이 중요합니다. 이 과정은 간단하지만 유충을 손상시키지 않도록 주의해야 하므로 집게를 사용하여 유충을 이동시키지 마십시오.

대신 브러시로 부드러운 움직임을 선택합니다. 세탁에 사용되는 물은 그 실온이며 증류되거나 세제가 포함되어 있지 않은 일반 수돗물입니다. 우리는 당신을 볼 수 있습니다.

그는 좋은 결과를 얻기 위해 유충을 음식에서 신선한 수돗물로 부드럽게 옮겼습니다. 유충을 가능한 한 짧은 시간 동안 물 속에 두는 것도 중요합니다. 이렇게 하면 기관에 물이 들어가는 것을 방지하여 호흡과 마취 과정을 방해합니다.

다음으로, 이미징 챔버를 준비합니다. 첫째, 우리는 챔버의 바닥 요소에 매우 얇은 기름 층을 펴 바릅니다. 그런 다음 이 기름 필름 위에 유충을 놓습니다.

여기서 엔딩이 기름에 닿지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 일단 배치되면 여기 유충 위에 스페이서 그리드를 배치합니다. 세 개의 채널이 위쪽을 향하도록 하여 공기가 유충으로 유입되고 기름으로 막히지 않도록 하는 것이 중요합니다.

이제 스페이서 위에 커버 슬립을 놓고 유충이 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 즉, 복부 쪽은 아래를 향하고 있고 기관이 끝난 등쪽 쪽은 기관이 위쪽을 향하고 있음을 볼 수 있습니다. 이제 플라스틱 적응형 링과 금속 링을 넣어 용암이 두 개의 유리 슬라이드 사이에 부드럽게 눌려지도록 합니다.

이제 이미징 챔버를 닫고 컨포칼 현미경으로 재배치하여 이미징을 시작합니다. 이제 ya는 이미징 챔버에 장착된 유충을 배치합니다. 컨포칼 현미경 위에.

이미징 챔버에서 나오는 세 개의 튜브가 있습니다. 하나는 마취제인 디스 플루오린에 부착되어 있습니다. 하나는 배출 튜브이고 최종 튜브는 신선한 공기가 유충에 도달하도록 합니다.

유충실을 마취 장치에 연결한 후에는 유충이 올바른 위치에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그런 다음 Yao는 펌프를 통해 공기가 마취 시스템으로 유입되도록 합니다. 이때 챔버의 압력이 권장 최대값을 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다.

그런 다음 배출 튜브를 물에 넣어 공기 흐름이 있는지 확인합니다. 물병의 거품은 공기 흐름을 나타냅니다. 그는 이제 밸브를 천천히 열고 디스 플루오린이 튜브를 통해 잠시 흐르도록 합니다.

초기 마취 후에는 용암이 어떻게 반응하는지 확인하는 것이 중요합니다. 심장이 여전히 박동하고 있다면 보이는 것처럼 더 많은 마취를 적용해야 합니다. 다음 섹션에서는 현미경 아래의 용암을 보여드리겠습니다.

이제 우리는 현미경 아래에서 마취 과정의 중요한 부분을 볼 수 있습니다. 처음에는 근육이 계속 수축하는 유충의 움직임을 볼 수 있습니다. 움직임이 느려지기 시작하면 ya는 유충을 위아래로 스캔하고 마취가 이루어지는 것을 관찰합니다.

움직임이 느려지다가 마침내 멈춥니다. 여러 마취 펄스를 적용한 후 용암이 움직임을 멈췄고 현미경의 변경으로 인한 유일한 움직임이 보이는 것을 볼 수 있습니다. 마취 정도를 확인하려면 심장 박동을 확인하는 것이 중요합니다.

He yao는 주로 뚱뚱한 몸을 볼 수 있는 용암 깊숙이 집중합니다. 중요한 것은 심장을 둘러싼 영역을 볼 수 있고 심장 박동이 멈춰 유충이 이미징할 준비가 되었다는 것이 분명하다는 것입니다. 생체 내 이미징의 주요 어려움 중 하나는 관심 있는 신경근 접합부를 식별하는 것입니다.

이를 돕기 위해 유충을 스캔할 때 어떻게 보이는지 보여드리겠습니다. 그러면 우리가 일반적으로 이미징에 사용하는 신경근 접합부를 볼 수 있습니다. 이제 우리는 유충에 천천히 집중하기 시작합니다.

큐티클 표면에서 시작하여 일부 근육이 나타나고 사라지는 것을 볼 수 있습니다. 이들 중 일부가 강조 표시됩니다. 이 영화는 CD 8 막관통 도메인, GFP 및 철 채널 셰이커 단백질의 C 말단 영역을 포함하는 인공 융합 구조를 보여줍니다.

이 구조는 모든 근육막에 국한되어 신경근 접합부에서 증가된 존재를 보여줍니다. 이제 영화를 더 느리게 재생하고 그림 2와 3의 도움으로 개별 근육이 나타나고 사라질 때 식별할 수 있습니다. 이러한 파리는 생체 내 이미징을 학습하는 데 특히 유용하지만, 우리는 일반적으로 유충 발현 마커를 사용하여 시냅스의 시냅스 후 또는 시냅스 전 영역에만 레이블을 지정합니다.

이것들은 전체 근육 표면을 표시하지 않기 때문에 유충에서 동일한 위치를 식별하는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 이 영화에서는 RFP 태그 글루타메이트 수용체를 보여줍니다. 영화는 우리가 라베에 집중하는 것을 보여주고 우리는 개별 신경근 접합부를 강조했습니다.

영화를 다시 천천히 보여주면 그림 4를 사용하여 개별 신경근 접합부를 식별할 수 있습니다. 이제 우리는 이론을 가지고 있습니다. 실제 예를 보여 드리겠습니다.

이제 유충을 발현하는 MHC CD 8 GFP 셰이커의 신경근 접합 27에 초점을 맞출 것입니다. 디지털 줌을 증가시킨 후 신경근 접합부를 재배치한 다음 C 방향으로 중앙 영역으로 이동하여 유충이 적절하게 배치되고 과포화 또는 불포화 픽셀이 없는지 확인합니다. 과포화된 픽셀은 빨간색으로 볼 수 있으며 상대적으로 채도가 낮은 픽셀은 파란색으로 표시됩니다.

레이저 출력을 줄이고 다시 스캔합니다. 이제 적절한 게인과 레이저 강도를 갖게 되었으므로 더 이상 과포화 영역이 없습니다. 이제 신경근 접합부의 위치를 C 방향으로 표시하는 것이 중요합니다.

먼저 하단 스캔 위치를 표시한 다음 상단 스캔 위치를 표시하여 전체 CST 스택을 정확하게 기록할 수 있도록 합니다. 우리는 일반적으로 100나노미터 x 100나노미터의 픽셀 크기를 사용하며 C의 거리는 500나노미터입니다. 사진을 처리하기 위해 이미징 후 디콘볼루션을 완료할 계획이 없는 경우 게인은 노이즈를 방지하기 위해 적절한 수준으로 설정되지만 CST 스택이 완료되면 표백을 최소화하기 위해 더 약한 레이저 강도를 사용할 수도 있습니다.

M-H-C-C-D-H shaker GFP 구조체를 발현하는 신경근 접합부가 적절하게 기록되어 있습니다. 다음 섹션에서는 글루타메이트 수용체에 초점을 맞춘 유사한 프로세스를 완료합니다. RFP 태그 글루타메이트 수용체를 기록하기 위해 다시 큐티클을 통해 초점을 맞추고 이제 세그먼트 A 3에서 개별 신경근 접합을 볼 수 있습니다.

오른쪽 신경근 접합부를 확대한 후 시야의 중심으로 재배치합니다. 이전에 했던 것처럼 과도하거나 불포화된 픽셀이 없는지 확인해야 합니다. 다시 말하지만, 일부 픽셀이 과포화되어 있음이 분명해짐에 따라 설정을 조정하고 다른 테스트 스캔을 완료합니다.

이제 레이저 출력의 증가량이 적절하게 조정되었습니다. 이제 상위 위치를 식별하고 확인한 다음 하위 위치를 확인하여 CST 스택 제한을 설정하는 것이 중요합니다. 이제 신경근 접합부의 개별 평면을 스캔할 수 있습니다.

신경근 접합부 바로 아래와 위의 단면을 빈 스캔하여 거기에 위치한 일부 시냅스를 놓치는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 컨포칼이 스캔을 완료한 후 신경근 접합부를 투영하여 in vivo 이미징에서 얻은 일반적인 결과를 확인합니다. 신경근 접합부를 재식별하고 새로운 시냅스 또는 시냅스 배턴과 같은 변화를 식별할 수 있도록 나중에 완료된 스캔과 비교할 수 있도록 이 이미지를 보관하는 것이 중요합니다.

이미징에 성공한 후. 용암을 신속하게 깨우고 이미징 챔버에서 신속하게 제거하는 것이 중요합니다. Yao는 용암을 지속적으로 모니터링하면서 지금 이 작업을 완료하고 있으며, 불소가 아닌 신선한 공기가 시스템을 통해 순환하도록 마취 장치를 조정합니다.

그는 이제 챔버의 배출구를 물 속에 넣고 기포는 공기가 시스템을 통해 흐르고 있음을 보여줍니다. 그는 심장 박동이 다시 뛰기 시작하고 유충이 깨어나는지 확인하기 위해 유충을 지속적으로 모니터링합니다. 마취 과정과 유사하게, 유충이 성공적으로 깨어날 수 있도록 여러 번의 공기 펄스를 제공하는 것이 가장 좋습니다.

이제 현미경을 통해 ya가 무엇을 하는지 볼 수 있습니다. 우리는 그가 시스템에 공기를 공급하는 것을 볼 수 있습니다. 챔버에서 압력 변화가 발생하여 유충의 인위적인 움직임을 유도합니다.

결국, 유충은 스스로 움직이기 시작하고, 이것은 심장 운동이 시작될 때 가장 잘 나타나기 때문에, 우리는 이러한 움직임을 더 명확하게 볼 수 있도록 용암 속으로 집중합니다. 리드미컬한 비트는 유충이 성공적으로 깨어나는 것을 보여주는 것을 볼 수 있습니다. 유충을 성공적으로 깨운 후에는 이미징 챔버에서 유충을 회수하는 것이 중요합니다.

유충은 챔버의 바닥 부분에 있으므로 상단은 측면에 배치됩니다. Yara는 금속 추와 플라스틱 덮개를 제거합니다. 그런 다음 덮개 슬라이드를 제거한 다음 유충과 함께 플라스틱 스페이서를 제거합니다.

그는 브러시로 플라스틱 스페이서에서 유충을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 물에 잠깐 담그고 건조시켜 여분의 기름을 제거합니다. 용암은 이제 미리 으깬 음식에 넣고 다시 필요할 때까지 그대로 둡니다.