마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

이 절차의 목적은 마우스 T 세포에서 기능적 항원 특이적 T 세포 수용체를 발현하는 것입니다. 먼저, 레트로바이러스 발현 TCR을 패키징하기 위해 관심 TCR 유전자를 함유한 플라스미드로 레트로바이러스 생산 세포주를 transfection합니다. 다음으로, 쥐의 비장에서 T 세포를 분리 및 정제하여 첫 번째 단계에서 생성된 레트로바이러스로 이러한 정제된 T 세포를 감염시킵니다.

마지막으로, 형질도입된 T 세포를 확장하여 상당한 수준의 수용체를 발현하고 얻습니다. 궁극적으로 유세포 분석을 통해 마우스 T 세포에서 기능적 항원 특이적 TCR의 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Michelle Crow Guard입니다.

저는 NYU 의과대학의 NYU 암 연구소에서 근무하고 있습니다. 오늘 우리는 1차 T-세포를 transduction하는 방법을 보여줄 사람으로, 이 방법을 보여줄 사람은 실험실의 박사후 연구원인 shiong, 실험실의 대학원생인 Kaleena Melek, 실험실의 박사후 연구원인 Arian Perez Garcia입니다. 형질전환 마우스와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시간이 훨씬 적게 소요된다는 것입니다.

이 방법은 어떤 TCR이 항원에 대해 더 나은 반응을 보일 수 있는지와 같은 주요 면역학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 암 환자의 치료에 유망한 것으로 밝혀진 양자 T 세포 전달 요법에 적용될 수 있으며, T 세포 수용체 알파 및 베타 사슬의 동등한 발현을 보장하기 위해 인간 T 세포의 체외 변형으로 구성됩니다. 관심있는 유전자를 동일한 promoter의 제어 하에 있는 동일한 레트로바이러스 벡터로 subclone합니다.

Kyogen Maxi 준비 키트를 사용하여 고품질 혈장 DNA를 준비하고 마이크로리터당 1마이크로그램의 재고를 만듭니다. 백금 E 레트로바이러스 패키징 셀이 있는 플레이트에서 배지를 제거하고 XPBS 1개로 플레이트를 한 번 세척합니다. 트립신 EDTA를 첨가하여 세포를 제거하고 섭씨 37도에서 몇 분 동안 배양합니다.

DMEM 배지로 제거된 세포를 중화하고 매 튜브로 옮깁니다. 다음으로 1000배 G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. supinate를 흡인하고 DMEM 배지에서 세포 펠릿을 재현탁합니다.

세포 수를 결정하고 세포를 0.6 곱하기 10으로 1밀리리터 플레이트당 6으로 희석합니다.10mm 폴리리신으로 코팅된 조직 배양 플레이트에 10ml의 세포 현탁액을 넣고 섭씨 37도의 세포 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 밤새 성장합니다. 다음 날 아침, 광학 현미경으로 세포를 검사하여 약 80%의 co-fluency를 확인합니다.

플레이트에서 미디어를 부드럽게 제거합니다. XPBS 1개로 세포를 한 번 세척하고 페니실린 또는 스트렙토마이신이 없는 예열 신선한 DMEM 배지 10ml를 추가합니다. lip mean transfection complex의 경우, 두 개의 혼합물을 준비하고 DNA의 opti ME M1과 다른 DNA의 lipectomy 시약을 실온에서 5분 동안 별도로 평형화합니다.

그런 다음 부드럽게 섞어 20분 동안 배양합니다. 실온에서 혼합물을 백금 E 세포에 천천히 떨어뜨립니다. 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 트랜스펙션 혼합물을 고르게 분배합니다.

그런 다음 세포 배양기에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다. 6-8시간 후, 바이러스 생산을 위해 배지를 10ml의 새로운 DMEM 배지로 교체합니다. 마우스의 비장을 채취하여 RPMI 배지로 옮깁니다.

비장을 세포 여과기에 넣습니다. 주사기 플런저로 비장을 으깨서 5cm 조직 배양 플레이트에 넣습니다. 세포 여과기에서 멸균 PBS로 세포를 헹구어 5분 동안 1000배 G로 원심분리하는 세포를 수확합니다.

sup natant를 버리십시오. Resus를 CK 용해 완충액에 세포 펠릿을 현탁시켜 계속합니다. 비장당 2밀리리터를 첨가하여 2분 동안 배양합니다.

실온에서. RPMI 배지를 최대 20ml까지 첨가하고 1000배 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 세포 펠릿을 멸균 PBS에 재현탁합니다.

세포 수를 측정하고 섭씨 4도에서 5분 동안 1000배 G로 원심분리합니다. 바이러스 형질도입 전에 마우스 T 세포를 활성화하기 위해 활성화 항체, 즉 항 CD 3 엡실론 및 항 CD 28로 플레이트를 코팅합니다. 멸균 PBS에서 항 CD 3 밀리리터 당 1 마이크로 그램, 안티 CD 28 밀리리터 당 2 마이크로 그램의 항체 혼합물을 준비하고, 항체 혼합물 250 마이크로 리터를 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분배하고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양합니다.

제품 설명서에 따라 비장 세포를 자기적으로 표시합니다. 자기장에 LS 컬럼을 놓습니다. 라벨링된 세포 현탁액을 컬럼에 적용합니다.

농축된 마우스 CD 8개 이상의 T 세포를 통해 흐름을 수집합니다. 3ml의 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 이전 블로우 스루와 결합합니다. anti CD 3 epsilon 및 anti CD eight alpha 항체로 세포를 염색하고 유세포 분석을 분석했습니다.

다음으로, 5분 동안 1000배 G로 세포를 원심분리하고 재조합 human IL two를 사용하여 RPMI 배지에서 cell pelle을 밀리리터당 100만 개의 세포로 재현탁합니다. 활성화 플레이트에서 항체 용액을 제거합니다. 멸균 PBS로 각 웰을 헹굽니다.

각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에 놓습니다.세포 인큐베이터에 5%이산화탄소. 바이러스가 생산된 지 이틀이 지나면 백금 ESE 세포판의 배지가 노란색이 되어야 합니다.

바이러스 supinate를 15ml 원뿔형 튜브로 옮겨 세포 파편을 제거합니다. 바이러스 S 상층액을 1000배 G로 5분 동안 원심분리한다. 바이러스 supinate를 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

튜브 바닥에 약간의 액체를 남겨두고 세포 파편을 방해하지 마십시오. 플레이트에서 활성화된 T 세포를 50mm 원뿔형 튜브로 수집합니다. 셀 번호를 확인합니다.

일부 세포를 별도의 튜브에 저장하여 1000배 G에서 5분 동안 음성 대조군 원심분리기로 사용하고 앙와위 natant를 폐기합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 바이러스 supine에 재현탁시킵니다. 10에서 밀리리터당 6개의 세포에 재조합 인간의 밀리리터당 20나노그램, 인터루킨 2개 및 단백질 황산염 밀리리터당 10마이크로그램

제어 튜브용 24웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 소생. RPMI 배지에서 동일한 양의 재조합 human, interleukin two 및 protein sulfate와 동일한 세포 밀도로 세포를 현탁시킵니다. 같은 플레이트에 셀을 추가합니다.

플라스틱 필름 원심 분리기로 플레이트를 섭씨 2000도에서 9000회 G에서 휴식 없이 32분 동안 감쌉니다. 원심분리 후 플라스틱 필름을 제거합니다. 1밀리리터의 새로운 RPMI 배지와 1밀리리터당 20나노그램의 재조합 인간 인터루킨을 각각 2개씩 넣고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

형질도입된 T 세포를 매일 검사하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 셀을 1-3 비율로 나눕니다. 세포가 과도하게 자라거나 배지가 6일째 또는 7일째에 노랗게 변하지 않도록 하십시오.

T세포 표면에서 TCR의 발현을 평가하기 위해 TCR에 특이적인 항체와 MHC 테트라머로 세포를 염색합니다. UNSD T 세포를 대조군으로 사용합니다. 이러한 형질도입된 T 세포는 이제 추가 다운스트림 응용 분야를 위한 준비가 되었습니다.

바이러스 형질도입 전. T 세포에서 TCR의 발현 수준을 평가하기 위해 상용 마그네틱 비드를 사용하여 고순도 T 세포 subset을 얻는 것이 유리합니다. TCR 알파 또는 베타 사슬에 특이적인 항체를 사용할 수 있습니다.

일반적으로 세포의 30%에서 80%는 TCR 유전자와 바이러스 역가에 따라 형질도입된 TCR을 발현할 수 있습니다. TCR에 특이적인 MHC 테트라머는 TCR의 기능적 발현을 추가로 검증하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따라 세포를 건강한 상태로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 세포 독성, 산 또는 사이토카인 방출 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 transduce의 특이성 및 민감도와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. TCR.

이 동영상을 시청한 후에는 좋아하는 TCR을 일차 T 세포로 transduction하는 전문가가 될 것입니다. 그럼 실험실에서 뵙겠습니다.