살아있는 세포와 투과화된 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하기 위한 산소 플럭스 측정

포유류 세포 현탁액을 배지가 들어 있는 호흡계 챔버에 넣고 마개로 밀봉하여 산소 측정을 위한 폐쇄형 시스템을 만듭니다.

각 챔버 내의 센서는 실시간 산소 플럭스, 즉 세포 산소 소비율을 측정합니다.

마개를 통해 디지토닌을 주입하여 세포막을 투과화하여 세포질 성분이 확산되도록 합니다.

이는 미토콘드리아 전자 전달 사슬에 대한 기질 가용성을 감소시켜 산소 플럭스를 낮춥니다.

미토콘드리아에 들어가 전자 운반체를 생성하는 피루브산과 말산염을 도입합니다.

이 운반체는 ETC의 복합체 I 및 II에 전자를 기증하여 전자 전달을 시작하고 산소 플럭스를 증가시킵니다.

ADP를 주입하여 ATP 합성을 시작하여 산소 플럭스를 더욱 높입니다.

다음으로, 언커플러를 단계적으로 적정하여 양성자 구배를 방해하고 산소 플럭스를 최대화합니다.

마지막으로 항마이신 A를 주입하여 복합체 III를 억제하여 전자 수송을 중단하고 산소 플럭스를 최소화합니다.

이 플럭스 프로파일은 투과화된 세포에서 미토콘드리아 호흡을 보여줍니다.

시작하려면 미토콘드리아 호흡 배지 MiR05를 깨끗한 Oroboros 챔버에 추가합니다. 스토퍼를 삽입하여 챔버를 닫고 흡입 시스템을 사용하여 스토퍼 콘센트에서 초과 매체를 빨아들입니다.

HEK 293T 세포를 추가하기 전에 밀리리터당 100만 세포의 실험 농도를 달성하는 데 필요한 세포 스톡 현탁액의 부피를 계산합니다.

그런 다음 챔버에서 마개를 제거하고 랙에 놓습니다. 피펫을 사용하여 계산된 세포 스톡 현탁액의 부피에 해당하는 챔버에서 MiR05 Vout의 부피를 제거합니다.

피펫을 사용하여 세포 스톡 현탁액을 완전히 재현탁한 후, 계산된 부피를 챔버에 추가합니다.

챔버를 닫으려면 내부에 기포가 갇히지 않도록 마개를 삽입하십시오. 흡입 시스템으로 스토퍼 용기에서 과도한 액체를 빨아들입니다.

일반적으로 약 15분이 소요되는 산소 플럭스가 안정화될 때까지 기다리십시오.

산소 플럭스의 흔적은 두 챔버의 상단 패널에 표시되고 산소 농도는 하단 패널에 표시됩니다.

마이크로 시린지를 준비하려면 적정할 화학 물질의 유형과 부피에 따라 적절한 주사기를 선택하고 세척하십시오. 마이크로 시린지를 주사기 랙에 놓습니다.

이제 기포를 피하면서 호흡 기질-언커플러-억제제 적정 또는 SUIT 프로토콜에 따라 주사기에 화학 물질을 로드합니다. 필요한 부피보다 최소 1마이크로리터 더 많은 주사기를 채웁니다.

유리 배럴의 원하는 표시에 도달할 때까지 플런저를 눌러 바늘 끝에 작은 방울이 나타나도록 합니다. 적정을 진행하기 전에 화학 바이알 벽에 떨어진 방울을 닦아냅니다.

적정을 수행할 때 유리 배럴의 종단이 스토퍼와 접촉할 때까지 바늘을 스토퍼 모세관을 통해 완전히 삽입해야 하며 화학 물질을 챔버에 신속하게 주입해야 합니다.

이 특정 SUIT 프로토콜을 시작하려면 두 챔버에서 밀리리터당 5마이크로그램의 실험 농도에 디지토닌을 추가합니다. 그런 다음 이벤트 창에서 확인을 클릭하여 두 챔버에 해당하는 이벤트를 설정합니다.

마개 용기에서 과도한 액체를 빨아들입니다. 산소 플럭스가 안정화될 때까지 기다렸다가 최소 2분 동안 기록합니다.

피루브산을 양쪽 챔버에 적정한 다음 말레이트를 적정하여 각각의 실험 농도에 도달합니다. 이벤트 창에서 확인을 클릭합니다.

이제 마개 용기에서 여분의 액체를 빨아들이고 플럭스가 안정화될 때까지 기다린 다음 약 2분 동안 기록합니다.

그런 다음 ADP를 2.5밀리몰의 실험 농도에 추가하고 이벤트 창에서 확인을 클릭합니다.

여분의 액체를 제거한 후 플럭스 안정화를 기다립니다. 플럭스가 안정화되는 데 최대 20분이 걸릴 수 있습니다.

그런 다음 CCCP를 사용하여 0.5마이크로몰 단위로 이 과정을 반복하여 최대 플럭스에 도달합니다.

항마이신 A를 첨가하여 2.5마이크로몰의 실험 농도에 도달합니다.

플럭스가 안정화되면 측정 중지라고 표시된 버튼을 클릭합니다.

데이터 분석을 위해 레이아웃을 오버레이에서 별도의 챔버로 전환합니다. 플럭스 플롯의 안정적이고 대표적인 섹션에 표시를 설정하여 적정 아티팩트를 방지합니다.

상단 메뉴에서 마크를 선택한 다음 통계 마크를 선택합니다. 드롭다운 메뉴 "통계 모드"에서 중앙값을 선택하고 클립보드에 복사를 클릭하여 추가 분석을 위해 데이터를 전송합니다.