치킨 청각 Brainstem 슬라이스의 준비 및 문화

이 절차의 전반적인 목표는 체외 전체 세포 생리학 또는 장기 유기형 배양에 사용할 닭, 청각 뇌간 조각을 준비하는 것입니다. 이것은 먼저 난자에서 배아를 제거함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 두개골에서 뇌를 해부하고 청각 뇌간 영역을 분리하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 바이옴에서 뇌간 영역의 절편을 준비하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 생리학 기록을 위해 뇌간 절편을 챔버에 배치하거나 배양을 위해 Millipore 플레이트에 배치하는 것입니다. 궁극적으로, 생리학적 기록 또는 장기간의 유기형 배양을 통해 닭 배아에서 건강한 청각 뇌간 조각을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Armand Sidle입니다. 이 두 가지 방법 모두 조류의 청각 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 지형적 엑손 재생, 수상돌기 역학, 이 바이노럴 청각 회로의 독특한 구조와 기능으로 인한 고유 및 시냅스 특성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 생리학적 및 배양 접근법을 위한 실행 가능한 샘플을 얻기 위해 조직을 신속하게 해부, 절단 및 보관해야 합니다. 먼저 증류수 1밀리리터당 한천 40mg을 넣고 전자레인지에서 끓을 때까지 가열하여 4% 한천 용액을 만듭니다.

뜨거운 한천 용액을 페트리 접시에 붓고 굳어지면 단단해질 때까지 식힙니다. 한천의 작은 블록을 잘라내어 비브라토 스테이지에 붙입니다. 다음으로, 나중을 위해 500-1000ml의 인공 뇌척수액 또는 A CSF를 준비합니다.

95% 산소, 5% 이산화탄소 pH 범위, 7.2 - 7.4 및 리터당 295 - 310 밀리 오스몰의 삼투압의 혼합물로 지속적으로 버블링하여 비브라토 스테이지 챔버에서 사용합니다. A CSF가 버블링하는 동안 70% 에탄올로 배양 영역, Vibram 및 블레이드로 해부를 청소합니다. 비브람 칼날을 증류수로 헹구고 건조시킨 다음 해부 부위에 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓고 일반적으로 메스, 가위, 핀, 면도날, 핀, 페트리 접시 및 주걱으로 구성된 적절한 해부 도구를 멸균 조직 배양 후드 아래에 놓고 닭 배아 6개당 1개의 우물을 채웁니다.

1 밀리리터의 배양액으로 웰 플레이트를 만들고 섭씨 35도에서 배양하고 5 % 이산화탄소를 배양합니다. 필요한 만큼 배양 멤브레인 인서트를 준비하고 나중에 사용할 수 있도록 후드에 보관하십시오. 해부 패드에 사용하십시오.

광원 아래에 난자를 놓아 일반적으로 난자의 큰 면인 배아의 빈 공기로 채워진 공간을 찾습니다. 주걱의 평평한 끝을 사용하여 난자의 큰 면을 부수어 막 자루를 노출시킵니다. 메스나 가위로 막 주머니를 한 조각 만들고 주걱으로 닭 배아의 머리를 부드럽게 추출합니다.

가위를 사용합니다. 배아의 머리를 빠르게 참수하십시오. 면도날 끝을 눈 중앙에서 약간 뒤쪽에 놓고 두개골을 통해 정중선을 절개하기 위해 복부를 만듭니다.

어린 배아를 위해 부드러운 압력을 가합니다. 나이가 많은 배아에게는 압력을 줄이십시오. 절개가 이루어졌으므로 더 많이 사용하십시오.

나이가 많은 동물이 두개골을 노출시키고 정중선을 확인할 수 있도록 피부와 깃털을 부드럽게 옆으로 밀어냅니다. 삭감. 강한 압력을 사용하여 면도날로 잘라 두개골의 윗부분 부분을 막습니다. 칼날을 눈 뒤쪽에 놓고 두개골과 뇌 조직 전체를 빠르게 잘라냅니다.

막힌 티슈를 코들 면이 위를 향하도록 하여 페트리 접시에 놓습니다. 외측 근육 부위를 통해 조직을 고정하고 거품이 있는 상태로 완전히 잠깁니다. CSF입니다.

두개골의 꼬리 부위에 작은 가위로 정중선을 만들고 머리 양쪽에 보이는 목 근육보다 약간 앞쪽에 절개합니다. 두개골과 조직을 당겨 소뇌와 뇌를 드러냅니다. 이제 뇌 조직이 노출되었으니, 소뇌와 뇌간의 위치를 파악하여 두개골에서 조직을 제거한다.

작은 가위를 사용하여 두개골 기저부에서 복부 쪽의 뇌간을 둘러싸고 있는 부속 조직을 부드럽게 잘라냅니다. 두개골에서 뇌간을 제거하면, 안경을 통해 시가가 채워진 페트리 접시에 고정시킵니다. 그런 다음 작은 가위로 꽃자루를 잘라 소뇌를 완전히 제거하고 제 4 심실의 바닥을 노출시킵니다.

핀셋을 사용하여 뇌간 표면에서 조직과 혈관의 막을 제거하고 시신경 테타를 통해 측면을 절단합니다. 뇌간을 분리하려면 각진 핀셋을 사용하여 부드럽지만 빠르게 한천 블록 앞의 Vibram 스테이지에 소량의 초강력 접착제를 놓습니다. 척수에서 뇌간을 들어 올리고 조직을 초접착제 위에 올려 놓고 윗면 쪽이 아래를 향하고 등쪽 면이 비브람 블레이드를 향하도록 합니다.

종이 티슈나 여과지로 여분의 접착제를 제거하십시오. vibram stage를 약 100ml의 산소가 함유된 A CSF로 부드럽게 채웁니다. 슬라이싱이 빠르게 수행되는 경우 준비된 산소화 A CSF를 사용해도 됩니다.

첫 번째 섹션에서. Vibram stage에 대해 20-22도 각도가 되도록 vibram 블레이드를 배치합니다. 최대 진동 진폭에서 vibram을 시작합니다.

그런 다음 s를 이동합니다.tage 조직의 상단이 블레이드와 평행이 되도록 블레이드 위로 이동합니다. 자르기 전에. 칼날을 뇌간 조직 쪽으로 빠르게 움직이되 칼날이 조직에 닿기 직전에 상당히 속도를 늦춥니다.

이제 블레이드가 제자리에 놓였으므로 가능한 가장 느린 전진 동작으로 조직을 자르기 시작합니다. 조직의 전체 관상 부분을 통과한 후 붓으로 칼날에서 조각을 부드럽게 제거하고 버립니다. 비브라토 스테이지를 300-500마이크로미터 단계로 낮추고 슬라이스합니다.

다시 말하지만, 뇌간 조직에서 해부학적 서명이 보일 때까지 반복하고 이전의 모든 조각을 버립니다. 이제 청각 구조를 포함하는 뇌간 조직을 200에서 1000으로 잘라서 수집합니다. 마이크로미터 두께로, 사용 가능한 슬라이스를 슬라이스 순서로 조심스럽게 수집합니다.

이 비디오의 뒷부분에 표시될 체외 생리학에 슬라이스를 사용하려는 경우, 이 시점에서 상단은 열린 속이 빈 플라스틱 튜브와 하단에는 접착된 나일론 메쉬로 만들어진 맞춤형 챔버에 개별적으로 보관해야 합니다. 각 개별 챔버는 약 350밀리리터의 CSF가 지속적으로 거품이 발생하는 더 큰 저장 챔버에 부착됩니다. 유기 유형 배양에 슬라이스를 사용하는 경우, 한쪽 끝에 고무 전구가 장착된 화염 광택 유리 피펫을 얼음 위의 48웰 플레이트에 사용하여 약 500밀리리터의 A CSF가 포함된 슬라이스 수집 전사 슬라이스 바로 다음에 나오는 다음 섹션을 참조하십시오.

웰당 한 조각을 놓고 슬라이스 순서를 유지합니다. 완료되면 한 뇌의 모든 조각을 수집하고 48웰 플레이트를 조직 배양 후드로 가져옵니다. 인큐베이터에서 이전에 준비한 6개의 웰 플레이트를 꺼내 후드로 가져옵니다.

멤브레인 인서트를 배양 배지가 있는 우물에 넣고 아래에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 유리 피펫을 사용하여 A CSF 한 방울에 한 조각을 촉촉한 멤브레인에 옮깁니다. 마이크로 피펫으로 여전히 위에 있는 여분의 A CSF를 삽입하고 제거합니다.

멤브레인당 최대 4개의 슬라이스에 대해 반복하고 슬라이스가 서로 닿거나 멤브레인의 가장자리에 닿지 않도록 배치합니다. 배양물을 섭씨 35도의 인큐베이터에 보관하고 조직 배양 후드 아래에서 일주일에 세 번 배양 배지를 교체하여 유지합니다. 고무 전구와 함께 한쪽 끝에 장착된 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 각 조각을 개별 보관 챔버에 놓습니다.

슬라이싱 순서를 계속 유지합니다. 홀딩 챔버는 미리 준비된 A CSF로 채워져야 하며 생리학 실험 중 내내 95%의 산소, 5%의 이산화탄소의 혼합물로 지속적으로 거품을 일으켜야 합니다. 홀딩 챔버를 섭씨 35도의 수조에 약 1시간 동안 넣어 슬라이스가 평형을 이루도록 한 다음 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.

슬라이스는 따뜻한 목욕에서 꺼낸 후 최대 6시간 동안 사용할 수 있습니다. 실온에서 30분 후, 전기생리학 실험을 위해 시료를 보관실에서 현미경에 장착된 0.5ml 기록 챔버로 옮길 수 있습니다. 닭 청각 회로의 대표적인 개략도와 시험관 내 슬라이스 이미지가 여기에 나와 있습니다.

슬라이스 이미지는 청각 뇌간 영역의 전형이며 연습을 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. 청각 신경 또는 N에서 Magno cellis 또는 NM과 angularis 핵 또는 N na 모두에 대한 N의 흥분성 입력. NM은 뇌간 양쪽에 있는 핵, lamins 또는 NL에 양측 흥분성 입력을 투영합니다.

superior olivar nucleus 또는 SON의 억제 입력은 na, nm 및 nl로 투영됩니다. 여기, E 11 닭의 청각 뇌간의 관상 절편이 7일 후에 나와 있습니다. 문화에서.

뉴런은 면역조직화학적 방법을 사용하여 라벨링되었는데, 이는 소마(soma)에서 발생하는 미세소관 관련 단백질 2에 대한 항체이며 수상돌기는 뉴런을 녹색으로 라벨링합니다. NM 뉴런과 축삭돌기의 클러스터는 린 염료의 전기천공법을 통해 빨간색으로 표시됩니다. 흰색 화살촉으로 표시된 동측 nm 축삭 말단은 등쪽 NL 수상돌기로 돌출된 것을 볼 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 배양 4일 및 7일 동안 급성 및 배양 조직의 과분극 및 탈분극 전류 단계에 대한 반응으로 중첩된 막 전압 변화입니다. 과분극 전압 강하의 변화, 외부 전류의 강력한 감소 및 단일 활동 전위 발사는 슬라이스 배양 접근 방식에서 유사하게 발전합니다. 연령에 해당하는 급성 조직 휴지 막 전위와 비교하여 전위는 영하 55 마일에서 영하 60 밀리 볼트 사이였습니다.이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 15 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 적절한 멸균 기술을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다., 그리고 이 비디오를 본 후에는 생리학적 기록에 사용하거나 배양에 사용하기 위해 닭 청각 브레이드 줄기 조각을 준비하는 방법을 잘 이해해야 합니다.