구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

본 절차의 전반적인 목표는 혀의 종양 침습을 시각화하고 정량화할 수 있는 구강암 마우스 모델을 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 LifeAct-mCherry를 렌티바이러스(Lentiviral)로 감염시키고 안정적인 클론 선택 과정을 거쳐, 이광자 이미징(two photon imaging)이 가능한 구강 편평세포암 세포를 생성합니다. 그 다음, 마취된 마우스의 혀에 LifeAct-mCherry로 표지된 세포를 주입하여 누드 마우스(nude mice)에 정위 이종이식(orthotopic xenograft) 종양을 형성시킵니다.

그 후, 종양이 포함된 혀를 이광자 현미경으로 촬영합니다. 최종적으로, 신선한 혀 조직의 이광자 영상 촬영과 이후 일차 종양 및 지역적으로 침범한 세포군에 대한 컴퓨터 지원 3차원 재구성을 통해, 혀 근육 내 국소 구강 종양 침범을 정량화한 결과를 얻을 수 있습니다. 면역조직화학법이나 생체 발광 영상과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 종양 세포의 침범을 3차원으로 정량 측정할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 함의는 구강암의 치료적 개입으로 확장되는데, 이는 종양 침습에 관여하는 단백질 분석뿐만 아니라 항침습 치료 전략에 대한 전임상 화합물의 평가를 위한 모델 시스템을 제공하기 때문입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람은 혀에 종양 세포를 주입하고 이광자 현미경 관찰을 위해 혀를 준비하는 과정이 기술적으로 까다로우며 숙련도와 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 종양 주입과 이광자 관찰 단계는 배우기 어렵고 전문적인 기술이 필요하므로, 이 방법의 시각화 자료가 매우 중요합니다. 배양을 시작하려면.

10% FBS, 1% penicillin streptomycin 및 1% 비필수 아미노산이 첨가된 DMEM으로 구성된 완전 배지에서 인간 두경부 종양 세포주를 배양합니다. LIFE Act mCherry 코팅 서열을 pLenti 7.0 렌티바이러스 벡터로 옮기기 위해, 먼저 부모 mCherry cDNA의 SBF1 인식 부위에 세 개의 무음 돌연변이를 도입하는 부위 특이적 돌연변이 유발이 필요합니다. 다음으로, 양 끝에 EcoR1 및 SBF1 부위가 있는 수정된 Life Act mCherry 서열을 PCR로 증폭하여 pLenti 7.0에 서브클로닝합니다. 렌티바이러스 발현 시스템 배양에 따라 pLenti 7.0 LIFE Act mCherry 컨스트럭트를 생성하려면, 패키징 세포주 293T를 완전 배지에서 17~40% 밀도로 배양합니다.

CalFoss를 사용하여 PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS two 및 P-VSVG 벡터를 각각 3:2:1 비율로 세포에 transfection합니다. 24시간 후, 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 72시간 동안 12시간마다 배지를 수집 및 보충하며, 수집한 배지를 4°C에서 보관하여 LIFE Act M cherry가 안정적으로 발현되는 두경부 세포주를 제작합니다. 수집한 배지를 4°C에서 2000 RPM으로 10분간 원심분리하고, 바이러스가 포함된 상층액 1 mL를 OSC 19 또는 US CCC one 세포에 첨가하여 12시간 동안 배양합니다.

세포를 헹군 후, 바이러스 1 mL를 추가로 첨가하여 12시간 동안 더 처리합니다. 내성 콜로니를 선택하기 위해 200 mg/mL의 puromycin이 포함된 배지에서 세포를 2주 동안 배양합니다. 형광 현미경을 통해 mCherry 발현 여부를 확인하여 생존한 콜로니를 시각적으로 선별합니다. 멸균된 3 mm 클로닝 디스크를 사용하여 양성 콜로니를 개별적으로 trypsin 처리합니다.

동결 보관하거나 정위성 종양 이종이식편을 생성하기 위한 정위 주입에 사용할 때까지 200 mg/mL의 puromycin이 포함된 배지에서 양성 세포를 유지하십시오. trypsin-life Act. M cherry 발현 종양 세포를 원심 분리한 다음, 약 2.5 × 10⁴개의 세포를 50 µL의 완전 배지에 재현탁하십시오. 종양 세포를 27 gauge 0.5인치 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 주입하십시오.

다음으로 8주 된 암컷 athymic nude mice를 마취합니다. ketamine 80 mg/kg과 xylazine 10 mg/kg의 조합으로 투여합니다. 동물의 움직임이 멈추면 안연고를 도포하고, 발바닥의 발톱을 눌러 반응 여부를 확인합니다.

마우스를 37~40°C 사이의 가열 패드 위에 유지합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 혀 끝을 부드럽게 잡고 구강 밖으로 당깁니다. 각 혀의 한쪽 면에 세포를 천천히 주입하여 혀 중앙에 구형의 덩어리가 형성되도록 합니다.

마우스에 kg당 2.1 mg의 요힘빈(yohimbine)을 주사하고, 마취 회복 상태를 관찰하기 위해 다시 가열 패드 위에 둡니다. 마우스를 부드러운 transgenic dough 식단이 들어 있는 멸균 케이지에 넣습니다. 2~3일마다 마우스의 체중을 측정하고, 종양 발생 여부를 육안으로 모니터링합니다.

ex vivo 이미징을 위해 마우스 혀를 준비하려면, 서로 다른 시점에 종양을 보유한 마우스를 안락사시킵니다. 이산화탄소 흡입법을 사용하여 혀를 적출하고 1X PBS로 헹굽니다. 그 다음, 일반 취미 용품점에서 구입한 단사 재봉사와 8호 바늘을 사용합니다.

혀를 일반적인 파라핀 조직 매립 카세트의 한쪽에 부착합니다. 혀가 고정되면, 카세트 어셈블리 전체를 1X PBS에 담급니다. 즉시 이광자 현미경을 사용하여 혀를 처리하고 이미징합니다.

1X PBS가 담긴 60mm 디시에 혀 카세트를 담급니다. 이 디시를 이광자 현미경의 대물렌즈 아래에 위치한 신축식 캔틸레버 암의 맞춤형 홀더에 고정합니다. 40x 0.8 수치구경 수침 대물렌즈를 육안으로 확인 가능한 종양 병변 바로 위 또는 위에 배치합니다.

60 milliwatts의 강도와 755 nanometers의 입력 파장을 가진 티타늄 사파이어 레이저를 이용한 이광자 현미경으로 혀를 촬영합니다. M cherry 신호를 최적화하기 위해, 15에서 100 micrometers 사이의 전체 조직 깊이에 걸쳐 1 micrometer 간격의 깊이에서 1 micrometer 연속 레이저 스캐닝 이미지를 수집합니다. 이 설정을 통해 조직 깊이가 최대 1 millimeter인 종양까지 분석할 수 있습니다.

이미지 캡처를 위해 scan image를 사용하십시오. Scan image는 XY 갈바노미터 스캔 미러를 제어하기 위한 래스터 스캔 패턴의 2채널 출력을 생성하는 동시에, 데이터 수집 보드를 통해 광전증배관으로부터 최대 4채널의 신호 입력을 동시에 캡처합니다. Scan image는 대물렌즈의 Z축을 제어하여 Z-stack 이미지를 수집하며, 단일 또는 순환 모드로 타임랩스 이미지를 수집합니다.

이미지를 16비트 깊이의 단일 TIF 파일로 저장하십시오. Amira 소프트웨어를 사용하여 Z-스택 이미지 세트가 포함된 TIF 파일을 열고, 종양 이미지 스택을 하나의 3차원 이미지로 렌더링하십시오. TEX 기능을 사용하여 3차원 렌더링을 생성하십시오.

렌더링된 이미지에는 여러 개의 작은 분리된 침습 그룹(ig)을 포함한 커다란 원발성 종양 이미지가 나타날 가능성이 높습니다. 종양 부피를 측정하려면 원발성 종양 영역의 임계값을 설정하고, 이미지 스택의 각 슬라이스에서 배경 형광을 보정 및 제거하십시오. 각 침습 그룹에 대해서도 동일한 임계값 설정 절차를 반복하십시오.

원발성 종양과 모든 침습 그룹(ig)을 선택한 후, 원발성 종양의 부피 측정값과 X, Y, Z 종양 OID 좌표를 결정합니다. 중심 종양 지점으로부터 ig까지의 거리를 계산하기 위해, ti = NT × VT × dt 식을 사용하여 종양 침습 지수(tumor invasive index, ti)를 계산합니다. 여기서 NT는 이미지 내 ig의 총 개수, VT는 모든 ig의 총 부피, DT는 원발성 종양의 중심에서 모든 침습 그룹이 이동한 총 거리를 나타냅니다.

소프트웨어 내의 Nikon NIS elements로 원본 16 bit 흑백 팁 파일을 가져오면 지형적 세부 사항이 더 정밀한 3차원 렌더링을 생성할 수 있습니다. 이미지 스택으로부터 ND 파일을 생성하십시오. 그다음, 문서의 캘리브레이션을 수동으로 수행하여 픽셀 크기를 지정함으로써 더 고품질의 렌더링을 구현하십시오.

Z 평면에 추가 슬라이스를 추가하십시오. 이 그림은 NIS elements 또는 미러 소프트웨어에서 획득한 이광자 이미지의 로우 데이터 예시를 보여줍니다. 이 그림에 나타난 것과 같이, 소프트웨어를 사용하여 설암의 로우 데이터를 재구성할 수 있습니다.

이 패널은 Amira 소프트웨어의 TEX 기능을 사용하여 구현한 3차원 렌더링 예시를 보여줍니다. 여기서는 이미지 스택에서 개별 이광자 단면의 임계값을 설정하여 원발성 종양의 중심부(oid)뿐만 아니라 원발성 종양으로부터 침습한 그룹을 식별하는 예시가 제시되어 있습니다. 각 임계값 단면의 분석이 완료되면, Amira는 각 침습 그룹의 부피와 중심(Centro)으로부터 이동한 거리를 정량화합니다.

이 데이터는 그래프로 나타낼 수 있으며, 종양 세포 침습의 전체 수준에 대한 수치를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 일차 부위에 기인한 이미지는 기존의 병리학적 면역조직화학 염색으로 시각화한 종양의 대표 이미지와 기술된 프로토콜을 사용하여 촬영한 유사 종양의 3차원 이미지를 비교한 것입니다. 혀 적출부터 최종 3D 렌더링까지 숙달되면, 적절히 수행할 경우 이 기술은 약 2시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 바늘로 혀를 관통하여 종양 세포를 소실하거나 종양 채취를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 절차 이후에 치료 화합물이나 단백질 수준이 조작된 세포를 테스트하여 구강암 침습에 대한 효능을 결정할 수 있습니다.

in vivo 환경에서 렌티바이러스로 변형된 인간 종양 세포를 다루는 것은 위험하므로, 주입된 마우스를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용 및 BSL 2 인증 라미나 플로우 후드 내 작업과 같은 안전 예방 조치를 항상 준수해야 합니다.