구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

표시 셀 다중 광자 현미경을 통해 혀를 이내 구강 암 종양 침략의 양적 모니터링 마우스 모델을 생성에 관련된 기술의 포괄적인 개요는 제공됩니다. 이 시스템은 침입 방지 화합물의 분자 평가 및 약물 효능을위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 혀의 종양 침습을 시각화하고 정량화할 수 있는 구강암의 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이는 생명의 렌티바이러스 감염 Act M cherry 및 안정적인 클론 선택에 의한 두 개의 광자 이미징을 위한 구강 편평 암종 세포를 먼저 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 정소성 이종이식 종양은 마취된 마우스의 혀에 생명 Act M 체리 표지 세포를 주입하여 누드 마우스에서 생성됩니다.

그런 다음 혀를 포함하는 종양을 두 개의 광자 현미경으로 이미지화합니다. 궁극적으로, 신선한 혀 조직에 대한 두 개의 광자 이미징을 통해 혀 근육 내 정량화된 국소 구강 종양 침습을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 후속 컴퓨터 지원 원발성 종양 및 국소 침범 세포 그룹의 3차원 재구성을 통해 얻을 수 있습니다. 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 생물발광 이미징(bioluminescent imaging)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 종양 세포 침입을 3차원으로 정량적으로 측정할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 종양 침습에 관여하는 단백질의 분석을 위한 모델 시스템을 제공할 뿐만 아니라 항침습적 치료 전략에 대한 전임상 화합물의 평가를 제공하기 때문에 치료 중재 구강암으로 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 종양 세포를 혀에 주입하고 두 개의 사진 현미경 검사를 위해 혀를 준비하는 것이 기술적으로 까다롭고 기술과 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 두 광자 단계의 종양 주입은 배우기 어렵고 배양을 시작하려면 전문 기술이 필요하기 때문에 이 방법의 시각화는 매우 중요합니다.

10%의 FBS, 1%의 페니실린 스트렙토마이신 및 1%의 비필수 아미노산이 보충된 DMEM으로 구성된 완전한 배지의 인간 두경부 종양 세포주. LIFE Act M cherry 코팅 염기서열을 PLL 7.0 렌티바이러스 벡터 부위에 유도된 돌연변이 유발을 도입하기 위해서는 먼저 모 mCherry CD NA의 SBF 1개 인식 부위에 3개의 조용한 돌연변이를 도입해야 합니다. 다음 PCR은 측면 ECO R 1 SBF 1 부위로 Modified Life Act mCherry 서열을 증폭하고 PLL 7.0으로 subclent합니다. 렌티바이러스 발현 시스템 배양 후 PLL 7.0 LIFE Act M cherry 구축물을 생성하기 위해, 패키징 세포주 2 9 3 T 17 내지 40%가 완전한 배지에서 합류합니다.

Cal Foss를 사용하여 PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2 및 P-V-S-V-G 벡터를 각각 3:2:1 비율로 transfection합니다. 24시간 후 배지를 신선하고 완전한 배지로 교체하고, 72시간 동안 12시간마다 배지를 수집 및 보충하고, 수집된 배지를 섭씨 4도에서 보관하여 안정적인 수명의 두경부 세포주를 생성합니다. 수집된 배지를 섭씨 4도에서 10분 동안 2000RPM으로 회전시키고 바이러스를 포함하는 정화된 배지 1ml를 OSC 19 또는 US CCC one cells에 12시간 동안 추가합니다.

세포를 헹군 다음 12시간 동안 1ml의 바이러스를 더 첨가합니다. 2주 동안 pur mycin 1밀리리터당 200mg을 함유한 배지에서 세포를 배양하여 저항성 콜로니를 선택하고 생존 콜로니를 육안으로 선별하여 평생 동안 스크리닝합니다. Act m 체리 형광 현미경 검사에 의한 체리 발현, 트립신 눈, 멸균 3mm 클로닝 디스크를 사용한 개별 양성 콜로니.

펄 마이신(pur mycin) 밀리리터당 200밀리그램을 함유하는 배지에서 양성 세포를 동결될 때까지 유지하거나, 정소성 종양 이종이식 트립신 생명 Act를 생성하기 위해 정소성 주사에 사용된다. M 체리 발현 종양 세포는 배양액을 원심분리한 다음 50마이크로리터의 완전한 배지에서 4번째 세포에 약 2.5배 10회 재현탁한다. 27 게이지 1/2인치 바늘에 부착된 1밀리리터 주사기에 종양 세포를 로드합니다.

다음으로 마취, 8 주 된 암컷 흉선 여우. 케타민 1kg당 80mg과 자일라진 1kg당 10mg의 조합을 가진 누드 마우스 1마리. 동물이 움직임을 멈추면 눈 윤활 연고를 바르고 손톱으로 발판을 눌러 반응 상태를 확인합니다.

섭씨 37도에서 40도 사이의 가열 패드에서 마우스를 유지하십시오. 멸균 집게를 사용하여 혀끝을 부드럽게 잡고 구강 밖으로 빼냅니다. 각 혀의 한쪽에 세포를 천천히 주입하여 혀 중앙에 구근 덩어리를 만듭니다.

생쥐에게 yohi being이 킬로그램당 2.1mg을 주입하고 마취에서 회복하는 동안 모니터링하기 위해 가열 패드에 되돌려 놓습니다. 부드러운 형질전환 반죽 다이어트가 들어 있는 멸균 케이지에 쥐를 넣습니다. 2-3일마다 쥐의 체중을 측정하고 종양 발병을 육안으로 모니터링합니다.

생체 외 이미징을 위해 마우스 혀를 준비하려면 다른 시점에서 종양이 있는 마우스를 안락사시킵니다. 이산화탄소 흡입을 사용하여 혀를 추출하고 XPBS 1개로 헹굽니다. 그런 다음 지역 취미 가게의 모노 필라멘트 재봉실과 8 사이즈 재봉 바늘을 사용합니다.

혀를 기존 파라핀 조직 임베딩 카세트의 한쪽 면에 부착합니다. 텅이 움직이지 않으면 전체 카세트 어셈블리를 하나의 XPBS에 담그십시오. 즉시 2개의 광자 현미경을 사용하여 혀를 처리하고, 2개의 광자 현미경을 사용하여 혀를 이미지화합니다.

XPBS 1개가 들어 있는 60mm 접시에 혀 카세트를 담그십시오. 두 광자 현미경의 대물렌즈 아래에 위치한 개폐식 캔틸레버 암의 맞춤형 디자인 홀더에 접시를 고정합니다. 40 x 0.8 개구수 water dipping 대물 렌즈를 눈에 보이는 종양 병변 위 또는 위에 직접 놓습니다.

60밀리와트의 강도와 755나노미터의 입력 파장을 가진 티타늄 사파이어 레이저를 사용하여 두 개의 광자 현미경으로 혀를 이미지화합니다. M cherry 신호를 최적화하려면 15에서 100 마이크로미터 사이의 총 조직 깊이에 걸쳐 1마이크로미터 증분 깊이에서 직렬 1마이크로미터 레이저 스캐닝 이미지를 수집합니다. 이 구성을 사용하면 조직 깊이가 최대 1mm인 종양을 분석할 수 있습니다.

이미지 스캔을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 스캔 이미지는 래스터 스캔 패턴의 2채널 출력을 생성하여 XY 갈반 미터법 스캔 미러를 제어하는 동시에 데이터 수집 보드를 통해 광 증배기 튜브에서 동시에 입력된 최대 4채널 신호를 캡처합니다. 스캔 이미지는 대물렌즈의 Z축을 제어하여 Z 스택 이미지를 수집하고 단일 또는 순환 모드에서 타임랩스 이미지를 수집합니다.

이미지를 16비트 깊이의 단일 TIF 파일에 저장합니다. Amira 소프트웨어를 사용하면 Zs 스택 이미지 세트가 포함된 TIF 파일을 열어 종양 이미지 스택을 단일 3차원 이미지로 렌더링할 수 있습니다. TEX 함수를 사용하여 3차원 렌더링을 생성합니다.

여러 개의 더 작은 해리된 침습성 그룹 또는 ig가 있는 큰 원발성 종양 이미지가 렌더링된 이미지에 존재할 수 있습니다. 종양 부피를 측정하려면 원발성 종양 영역의 역치를 정의하고 이미지 스택의 각 슬라이스를 배경 형광을 보정하고 제거합니다. 각 침입 그룹에 대해 임계값 설정 절차를 반복합니다.

원발성 종양과 모든 igs가 선택되면 원발성 종양에 대한 X, Y 및 Z 종양 OID 좌표뿐만 아니라 부피 측정을 결정합니다. 중심 종양 지점에서 igs의 거리를 계산하려면 ti가 N NT x VT x dt와 같은 것을 사용하여 종양 침습 지수 또는 ti를 계산합니다. 여기서 NT는 이미지의 총 igs 수와 같고, VT는 모든 igs의 총 부피와 같으며, DT는 원발성 종양의 중심에서 모든 침습성 그룹이 이동한 총 거리와 같습니다.

원본 16비트 흑백 팁 파일을 소프트웨어 내의 Nikon NIS 요소로 가져와서 지형 세부 사항이 더 세밀한 3차원 렌더링을 생성할 수 있습니다. 이미지 스택에서 ND 파일을 만듭니다. 그런 다음 문서를 수동으로 보정하여 더 높은 품질의 렌더링을 위한 픽셀 크기를 지정합니다.

Z 평면에 슬라이스를 더 추가합니다. 이 그림은 두 개의 광자 이미지 NIS 요소 또는 미러에서 얻은 원시 데이터의 예를 보여줍니다. 소프트웨어를 사용하여 이 그림에 표시된 혀 종양의 원시 데이터를 재구성할 수 있습니다.

이 패널은 Amira 소프트웨어의 TEX 기능을 사용한 3차원 렌더링의 예를 보여줍니다. 다음은 원발성 종양과 원발성 종양 중심 또는 oid에서 침습 그룹을 식별하기 위해 이미지 스택에서 개별 두 광자 단면을 임계값화하는 예입니다. 각 임계값 섹션을 분석한 후 Amira는 Centro에서 각 침입 그룹이 이동한 부피와 거리를 정량화합니다.

이러한 데이터는 그래픽으로 시연할 수 있으며 종양 세포 침습의 전체 수준에 대한 숫자 값을 얻는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 일차 부위에 기인하는 것은 설명된 프로토콜을 사용하여 유사한 종양의 3차원 이미지와 비교하여 기존의 병리학적 면역조직화학 표지에 의해 시각화된 종양의 대표적인 이미지입니다. 혀 추출 지점에서 최종 3D 렌더링까지 마스터하면 이 절차를 시도하는 동안 적절하게 수행하면 이 기술을 약 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 바늘로 혀를 뚫어 종양 세포를 잃고 종양 복용을 방해하지 않도록 주의하십시오. 구강암 침습에 대한 효능을 결정하기 위해 단백질 수치가 조작된 치료 화합물 또는 세포에 대한 검사를 수행할 수 있습니다.

생체 내 환경에서 렌티바이러스로 변형된 인간 종양 세포로 작업하는 것은 적절한 PPE와 같은 위험한 예방 조치이며 BSL에서 작업하는 것은 주입된 마우스로 작업하는 동안 항상 두 개의 인증된 층류 후드를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.