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복강 내 지방이 풍부한 조직인 대망은 전이성 암세포가 집락화하고 이차 종양을 형성하는 데 적합한 미세 환경을 제공하는 지방 저장소로 구성됩니다. 이 생체 외 집락화를 연구하려면 먼저 투과성 막 세포 배양 삽입물을 배양 플레이트 내부에 배치합니다.
인서트 멤브레인의 내부 영역에 조직 접착제를 도포합니다. 조직을 고정하기 위해 접착제 위에 마우스 대망 외식편을 놓습니다. 형광 표지된 난소암 세포의 현탁액을 대망 위에 부드럽게 파종합니다.
다음으로, 세포 성장을 보충하기 위해 웰의 측면을 적절한 배지로 채우고 원하는 시간 동안 배양합니다. 대망 조직에는 혈관 네트워크 주위에 빽빽한 면역 세포 클러스터인 유백색 반점이라는 특수 구조가 포함되어 있습니다. 이 면역 세포는 암세포를 유인하고 착상을 촉진하는 특정 화학 요인을 분비합니다. 집락화된 암세포는 전이성 상태를 시뮬레이션하여 증식합니다.
마지막으로 사용한 미디어를 버립니다. 대망 조직 내의 형광 암세포 콜로니를 평가하기 위해 형광 현미경을 사용하여 배양을 관찰합니다.
형광 태그가 부착된 세포를 성장 및 준비하고 밀리리터당 200만 개의 세포 농도로 재현탁합니다. 약 6마이크로리터의 조직 접착제를 배양 인서트의 멤브레인에 바르고 자연 건조시킵니다. 그런 다음 층류 후드 아래에서 멤브레인을 자연 건조하기 전에 멸균수로 멤브레인을 두 번 세척하여 과도한 접착제를 제거합니다.
대망을 조심스럽게 절제하고 멸균 겸자를 사용하여 접착제로 코팅된 멤브레인에 부착합니다. 조직이 1분 동안 막에 부착되도록 한 후, 각 배양 삽입물의 각 대망 위에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다.
그런 다음 트랜스웰 챔버 주변 영역을 2.5밀리리터의 DME/F-12 배지로 채웁니다. 5% CO2 환경에서 섭씨 37도에서 6시간 동안 세포 현탁액과 함께 대망을 배양합니다. 대망을 조심스럽게 제거하고 약 10밀리리터의 PBS로 씻습니다. 마지막으로, 적절한 형광 이미징 시스템을 사용하여 형광 암세포 병소를 시각화합니다.
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