IPE 및 RPE 세포 분리: 토끼 눈에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 기술

색소 상피 세포는 밀착 접합으로 연결된 말단적으로 분화된 입방체 세포입니다. 홍채를 감싸고 있는 이러한 상피 세포는 홍채 색소 상피 또는 IPE 세포이고 망막 근처에 있는 세포는 망막 색소 상피 또는 RPE 세포입니다.

이 세포를 추출하려면 온전한 토끼 눈을 채취하십시오. 눈 표면의 미생물을 제거하기 위해 소독제로 눈을 치료하십시오. 완충액으로 소독제를 씻어냅니다. 홍채 근처를 절개합니다. 이 개구부를 사용하여 홍채 경계를 따라 완전한 원형 절단을 만들어 눈을 홍채를 포함하는 앞쪽 부분과 망막과 유리체액으로 구성된 뒤쪽 부분으로 나눕니다.

전방 안부를 잡고 렌즈를 버리고 홍채에 접근합니다. 홍채를 제거하고 배양 접시에 놓습니다. 그런 다음 후방 분절을 채취하여 안구에서 젤라틴 질의 유리체액과 망막을 버립니다.

홍채와 안구를 트립신으로 처리하고 배양합니다. 트립신은 밀착 접합과 세포외 기질 단백질을 분해하여 상피 세포의 해리를 시작합니다. 트립신을 버리고 적절한 배양 배지를 추가합니다. 홍채와 안구 표면을 부드럽게 긁어 배지에서 상피 세포를 방출합니다.

마지막으로 IPE 및 RPE 세포를 별도의 웰에 시드합니다. 세포는 추가 다운스트림 분석을 위한 준비가 되었습니다.

동물을 안락사시킨 후 구부러진 가위와 Colibri 겸자를 사용하여 눈을 적출한 다음 눈에 남아 있는 근육 조직과 피부를 청소합니다. 비멸균 PBS로 채워진 50밀리리터 튜브에 눈을 모으고 튜브를 층류 후드로 옮깁니다. 요오드 기반 용액에 2분 동안 담가 소독한 다음 멸균 PBS로 채워진 50밀리리터 튜브로 눈을 옮깁니다.

한쪽 눈을 멸균 거즈 찜질에 대고 눈을 시신경 가까이에 단단히 고정한 다음 #11 메스로 홍채 한계 근처를 자릅니다. 가위를 사용하여 홍채 주위를 자르고 전방 분절을 제거한 다음 망막 색소 상피 또는 RPE 세포가 분리될 때까지 유리체와 함께 구근을 남겨두고 페트리 접시에 넣습니다.

홍채 색소 상피 또는 IPE 세포를 분리하려면 미세한 집게로 수정체를 제거하고 IPE 세포가 포함된 홍채를 조심스럽게 빼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 넣고 멸균 PBS로 세척합니다. 0.25% 트립신 500마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 트립신을 제거하고 500마이크로리터의 완전 배지를 추가한 다음 평평한 불 광택 파스퇴르 피펫으로 IPE를 섬세하게 긁어냅니다.

세포 현탁액을 모아 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다. Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수하고 1밀리리터의 완전 배지가 있는 24웰 플레이트에 웰당 20만 개의 세포를 시드합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다.

RPE 세포를 분리하려면 얇은 겸자로 후분절에서 유리체액과 망막을 제거합니다. 구근을 24웰 플레이트에 넣고 눈당 500마이크로리터의 0.25% 트립신을 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 트립신을 제거하고 글로브당 500마이크로리터의 완전 배지를 추가한 다음 구부러진 불 광택 파스퇴르 피펫으로 RPE 세포를 섬세하게 긁습니다.

세포 현탁액을 모아 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다. Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 앞서 설명한 대로 세포를 시드합니다. 접시를 인큐베이터에 넣습니다.