2차원 반변성 아가로스 겔 전기영동: 크기 이질성에 따라 다형성 아밀로이드 섬유를 분리하는 기술

아밀로이드 섬유는 크기 이질성을 나타내는 잘못 접힌 단백질의 응집체입니다. SDS와 같은 음이온 세제에 내성이 있는 이러한 섬유는 2차원 반변성 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석할 수 있습니다.

시작하려면 SDS가 포함된 사전 조립된 큰 기공 크기의 아가로스 겔을 섭취하십시오. 다공성이 높기 때문에 실행 중에 손상되지 않은 섬유를 분리할 수 있습니다. SDS가 포함된 실행 완충액으로 겔을 오버레이합니다.

아밀로이드 섬유를 포함하는 세포 용해물을 겔에 로드합니다. SDS의 존재와 시료 가열 단계의 부재는 세제가 저항성이 높은 아밀로이드에 결합하여 온전한 섬유에 균일한 음전하를 부여하는 반변성 조건을 만듭니다.

적절한 전압에서 첫 번째 차원에서 젤을 실행합니다. 전기장은 음전하를 띤 아밀로이드를 양전하를 띤 양극으로 이동하게 합니다.

실행 중에 작은 섬유는 큰 섬유에 비해 빠르게 이동하여 크기 이질성을 나타내는 번짐 모양의 밴드 패턴을 형성합니다.

완료되면 젤을 수직으로 회전시키고 2차원으로 실행합니다. 이 차원에서 섬유는 크기에 따라 분리되는 첫 번째 실행과 동일하게 이동합니다. 이것은 작은 섬유가 큰 섬유보다 더 빨리 이동하기 때문에 대각선 번지가 생성됩니다.

날카로운 대각선 밴드의 형성은 온전하지만 이질적인 아밀로이드 섬유 집단을 확인합니다.

겔을 준비하려면 유리 비커에 200ml의 TAE 완충액에 2g의 아가로스 분말을 첨가합니다. 그런 다음 비커를 전자레인지에 가열하여 아가로스를 녹입니다.

다음으로, 1 밀리리터의 20 % SDS를 0.1 %의 최종 농도까지 첨가합니다. 비커를 부드럽게 휘젓습니다.

다음으로, 액체 아가로스를 15cm x 14cm 젤 슬래브에 붓습니다. 기포를 제거하려면 1밀리리터 피펫을 사용하십시오. 그런 다음 젤 위에 20웰 빗을 놓습니다.

다음으로, 겔의 맨 오른쪽 레인에 약 60마이크로그램의 전체 세포 용해물을 추가합니다. 0.1% SDS를 함유한 TAE 완충액을 실행 완충액으로 사용하여 약 4시간 동안 겔을 60V에서 실행합니다.

젤을 2차원으로 실행하려면 젤을 시계 반대 방향으로 90도 조심스럽게 회전시킵니다. 그런 다음 감옥을 60볼트로 약 4시간 동안 가동합니다.