Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

잘못 접힌 단백질의 분해는 세포의 단백질 항상성을 유지하는 데 중요합니다.

잘못 접힌 단백질의 분해를 조사하려면 GFP 표지, 잘못 접히기 쉬운 단백질을 생성하는 형질감염된 세포가 포함된 배양 플레이트를 가져 와십시오. 응집체가 세포 내부에 축적될 때까지 형질감염된 단백질의 발현을 촉진하기 위해 플레이트를 배양합니다.

이제 이 세포를 단백질 번역 억제제인 시클로헥시미드로 다른 시간 간격으로 처리하고 세포를 급속 동결합니다. Cycloheximide는 새로운 단백질 합성을 억제합니다. 이것은 미리 형성된 잘못 접힌 단백질의 시간 의존적 분해를 연구하는 데 도움이 됩니다.

사용한 배지를 버리고 약한 비이온성 세제가 포함된 용해 완충액으로 세포를 처리합니다. 용해 시 세제 분자는 잘못 접힌 단백질의 단량체와 올리고머를 가용화하는 반면 응집체는 그대로 유지됩니다.

내용물을 원심분리하여 응집체를 펠릿화하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 도데실 황산나트륨(SDS)에 분배하고 완충액을 가열합니다. 이 처리는 무질서한 응집체를 변성시키는 반면 SDS 불용성 응집체는 손상되지 않은 상태로 유지됩니다.

사이클로헥시미드 처리의 서로 다른 시간 간격에 해당하는 모든 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 크기가 크기 때문에 SDS 불용성 응집체는 웰에 손상되지 않은 상태로 남아 있는 반면, 단량체와 SDS 용해성 단백질은 겔 내에서 이동하여 뚜렷한 밴드를 형성합니다.

샘플을 블롯하고 항-GFP 항체를 사용하여 시각화합니다. 더 긴 사이클로헥시미드 처리 후, SDS 가용성 단백질 밴드의 강도 감소는 시간이 지남에 따라 잘못 접힌 단백질 분해를 확인합니다.

Atxn1 82Q GFP에 대한 분해 분석을 수행하려면 DMEM 배지 및 10% FBS가 있는 35mm 플레이트에 약 3 x 10⁵ HeLa 세포를 플레이트합니다.

세포를 밤새 배양하여 형질감염 시 40% 내지 60% 합류에 도달하도록 한다. Atxn1 82Q-GFP/pRK5로 세포를 형질감염시킨 후 4시간 내지 5시간, 형광 현미경 아래에서, 450 내지 490 나노미터의 여기 파장을 사용하여 GFP 신호의 확산 및 작은 반점의 존재를 특징으로 하는 핵에서 GFP 발현에 대한 살아있는 세포를 검사한다.

사이클로헥시미드 처리 직전에 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 3밀리리터를 사용하여 세포를 두 번 세척하여 세포 한 플레이트를 수확합니다. 그런 다음 드라이아이스에 접시를 빠르게 얼립니다.

나머지 세포 플레이트의 경우, 진공 흡인으로 배지를 제거하고 사이클로헥시미드 밀리리터당 50마이크로그램을 함유하는 신선한 DMEM 2밀리리터를 첨가합니다. 또한 프로테아좀 억제제 MG132 10마이크로몰을 한 플레이트에 추가합니다. 처리된 세포를 4, 8, 12, 16시간 동안 배양한 후 드라이아이스에서 얼립니다.

16시간에 MG132 처리된 세포를 수확한 후, 모든 플레이트에서 냉동 세포를 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액으로 긁어내고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

벤치탑 원심분리기에서 용해물을 17,000 x g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 NP-40 가용성 단백질이 포함된 상청액을 다른 튜브로 옮깁니다.

펠릿을 방해하지 않고 약 200마이크로리터의 1x PBS를 튜브에 부드럽게 첨가하여 펠릿을 헹굽니다. 흡인이나 피펫으로 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 펠릿 완충액에 재현탁한 다음 얼음 위에서 15-30분 동안 배양합니다.

다음으로, 펠릿에서 재현탁된 NP-40-가용성 분획물과 NP-40-불용성 분획물에 75마이크로리터의 3x 끓는 완충액을 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 열 블록에서 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.

끓인 NP-40-가용성 및 불용성 분획의 분취량에 SDS-겔 로딩 완충액을 첨가합니다. 모든 시점에서 수집된 동일한 양의 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 항-GFP 항체 및 강화된 화학발광을 사용하여 웨스턴 블롯으로 NP-40 가용성 및 SDS 가용성 Atxn1 82Q GFP를 검출합니다.

필터 지연 분석으로 펠릿 분획에서 SDS 내성 Atxn1 82Q를 검사하려면 0.2미크론 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 고정하는 도트 블롯 장치를 설정합니다. 그런 다음 끓인 NP-40-불용성 샘플 80-120마이크로리터를 도트 블롯 장치의 각 웰에 로드합니다.

진공으로 멤브레인을 통해 샘플을 여과한 후 항-GFP 면역블로팅으로 멤브레인에 붙어 있는 Atxn1 82Q GFP 응집체를 검출합니다.