배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

내막 미토콘드리아 유니포터 복합체를 통한 세포질 칼슘 이온의 미토콘드리아 흡수는 기능에 매우 중요합니다.

미토콘드리아 칼슘 유입을 측정하려면 웰 바닥에 ECM 코팅 커버슬립이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다. 섬유아세포 현탁액을 커버슬립에 도금하고 세포가 ECM에 부착되도록 합니다.

비활성 에스테르화 적색 형광 칼슘 민감성 염료와 녹색 형광 미토콘드리아 선택적 염료를 포함하는 염료 혼합물을 추가합니다. 염료 분자가 세포 세포질에 들어갈 수 있도록 배양합니다.

미토콘드리아에 민감한 염료는 막을 통해 선택적으로 확산되고 미토콘드리아 기질에 국한됩니다. 칼슘에 민감한 염료는 미토콘드리아와 미토콘드리아 외 공간 전체에 퍼집니다. 미토콘드리아 내강 내부에서 내인성 에스테라아제는 적색 염료에서 에스테르 부분을 절단하여 미토콘드리아 내부에 갇힌 채로 남아 있는 막 불투과성 적색 형광단을 방출합니다.

계면활성제 함유 투과화 용액을 첨가합니다. 낮은 농도에서 계면활성제 분자는 세포의 원형질막 콜레스테롤을 제한적으로 용해시켜 미토콘드리아를 그대로 두고 칼슘에 민감한 염료 분자가 세포질 밖으로 누출되는 공간을 만듭니다. 이것은 미토콘드리아에 칼슘에 민감한 적색 형광단과 미토콘드리아 특이적 녹색 형광단을 선택적으로 유지합니다.

커버슬립을 공초점 현미경에 고정된 이미징 챔버로 옮기고 칼슘 함유 완충액을 추가합니다. 투과화된 세포 내에서 미토콘드리아 국소화된 칼슘을 나타내는 공동 국소화된 빨간색 및 녹색 형광을 나타내는 영역을 찾습니다. 적색 형광은 점차 증가하여 점진적인 미토콘드리아 칼슘 흡수를 나타냅니다.

Rhod-2/AM 20마이크로리터, MitoTracker Green 0.2마이크로리터, 20% 플루로닉 F-127 2.5마이크로리터, Tyrode 용액 1밀리리터를 혼합하여 Rhod-2/AM-MitoTracker Green 작업 용액을 준비합니다. NIH 3T3 세포로 도금된 이전에 준비된 커버슬립에 Rhod-2/AM-MitoTracker Green 용액을 덮을 때까지 적방울 첨가합니다. 세포에 염료를 로드하려면 실온에서 30분 동안 빛으로부터 보호된 커버슬립을 배양합니다.

Rhod-2/AM을 탈에스테르화하려면 Rhod-2/AM-MitoTracker Green 용액을 부드럽게 제거하고 약 300마이크로리터의 신선한 Tyrode 용액으로 교체하여 세포를 덮습니다. 빛으로부터 보호된 커버슬립을 실온에서 30분 동안 배양합니다.

이제 커버슬립을 현미경 이미징 챔버로 옮기고 챔버를 세척액으로 채웁니다. 초점을 조정하여 40배 배율로 세포와 위상차를 관찰합니다.

Rhod-2/AM-MitoTracker Green 로딩 세포의 원형질막을 투과화하려면 커버슬립에서 세척액을 제거하고 약 300마이크로리터의 투과용액으로 교체하여 세포를 덮습니다.

이 과정에서 원형질막 형태를 모니터링합니다. 투과화되면 세포는 표면이 거칠어집니다. 투과가 완료된 후 즉시 투과용액을 제거하고 칼슘 제로 내부 용액으로 교체하십시오.

다음으로, Rhod-2와 MitoTracker Green의 명확한 공동 국소화를 나타내는 투과화 세포에 초점을 맞춰 Rhod-2와 MitoTracker Green 형광을 동시에 이미지

다음으로, 현미경 레이저 및 게인 설정을 줄여 미토콘드리아 Rhod-2 형광을 어둡게 만들고 거의 보이지 않게 만듭니다.

미토콘드리아 칼슘 변화의 동역학을 캡처하려면 "현미경 설정"을 선택하여 적절한 프레임 속도와 시간 경과로 2차원 스캔을 획득합니다. 제로 칼슘 내부 용액을 제거하고 세포와 현미경 초점을 방해하지 않도록 한 다음 이미지 획득을 시작합니다.

주사기를 사용하여 10초 시점에서 칼슘이 풍부한 내부 용액을 수동으로 추가합니다. 마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어에서 Rhod-2 및 MitoTracker Green 신호의 공동 국소화 영역을 포함할 관심 영역을 선택합니다.