에스트로겐 수용체-리포터 활성 분석법은 식물성 에스트로겐 에스트로겐 활성을 스크리닝합니다.

에스트로겐은 내분비 신호 분자 역할을 하고 핵 수용체(에스트로겐 수용체 베타)에 결합하여 에스트로겐-베타 수용체 복합체를 형성하는 스테로이드 호르몬입니다.

이러한 리간드-수용체 복합체는 이량체화되어 세포 세포질에서 동형이량체를 형성합니다. 생성된 동형이량체는 핵에 들어가 에스트로겐 반응 요소인 ERE(표적 유전자의 프로모터 내의 특정 DNA 서열)에 결합하여 전사를 시작합니다.

에스트로겐 기능을 모방하는 식물 유래 2차 대사산물인 식물성 에스트로겐의 에스트로겐 활성을 결정하려면 적절한 배지에 현탁된 리포터 세포가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

리포터 세포는 에스트로겐 수용체 베타를 과발현하도록 조작되고 ERE 프로모터에 융합된 루시페라제 유전자로 형질감염됩니다. 식물성 에스트로겐이 함유된 샘플 용액을 첨가하고 배양합니다.

배양하는 동안 식물성 에스트로겐은 리포터 세포에서 발현되는 에스트로겐 수용체인 베타에 결합합니다. 일단 결합하면 식물성 에스트로겐-수용체 복합체는 이량체화되어 핵으로 전위됩니다.

핵 내부에서 이량체화된 복합체는 ERE에 결합합니다. 결합은 루시페라아제 유전자 전사를 시작하여 루시페라아제 효소를 생성합니다. 다음으로, 배지를 제거하고 루시페라아제 기질을 포함하는 시약을 추가합니다. 발현된 루시페라아제 효소가 기질을 산화시키고 발광을 생성하도록 배양합니다.

샘플에서 화합물의 에스트로겐 활성을 확인하는 발광을 측정합니다.

샘플을 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 각 샘플 4마이크로리터를 496마이크로리터의 화합물 스크리닝 배지에 첨가하여 0.8% DMSO 용액을 생성합니다.

예열된 세포 회수 배지 튜브의 외부 표면을 70% 에탄올로 소독하고 배지 10밀리리터를 냉동 리포터 세포 튜브에 옮겨 해동합니다. 리포터 세포 튜브를 닫고 섭씨 37도의 수조에 5-10분 동안 넣습니다.

수조에서 세포를 회수한 후 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포 응집체를 분해하고 균질한 현탁액을 생성합니다. 그런 다음 70% 에탄올로 튜브 표면을 청소합니다.

다중 채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 리포터 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 샘플을 적절한 웰에 세 번 분배합니다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 22-24시간 동안 배양합니다.

플레이트 배양이 끝나기 직전에 검출 기질과 검출 완충액을 냉장고에서 꺼내 실온과 평형이 될 때까지 저조도 장소에 두십시오. 그런 다음 각 튜브를 부드럽게 뒤집어 용액을 혼합합니다.

플레이트 배양이 완료되기 직전에 검출 완충액의 전체 내용물을 검출 기질 튜브에 부어 루시페라아제 검출 시약을 만듭니다. 거품이 생기지 않도록 튜브를 부드럽게 섞습니다.

샘플 플레이트의 내용물을 적절한 폐기물 용기에 버리고 깨끗한 흡수성 종이 타월을 가볍게 두드려 웰에서 마지막 물방울을 제거합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 루시페라아제 검출 시약을 첨가하고 분석 플레이트를 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 96웰 플레이트 판독 발광계를 사용하여 발광을 정량화합니다.