DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯

DNA 메틸화는 DNA의 시토신 염기에 메틸기를 추가하여 5-메틸시토신을 형성하는 후성유전학적 변형입니다. 이 변형은 유전자 발현을 변경합니다.

도트 블롯을 통해 DNA 메틸화를 정량화하려면 다양한 수준의 메틸화 시토신을 나타내는 다양한 탈분화 단계에서 인간 연골 세포에서 유래한 게놈 DNA 샘플을 채취합니다.

DNA 샘플을 강알칼리인 수산화나트륨으로 처리하고 가열합니다. 이 처리는 두 DNA 가닥 사이의 수소 결합을 끊어 DNA 변성을 일으킵니다. 아세테이트 암모늄을 첨가하여 알칼리를 중화시켜 과도한 DNA 분해를 방지합니다.

나일론 멤브레인을 가져와 변성 DNA 샘플을 점으로 발견합니다. 음전하를 띤 DNA는 정전기 상호 작용을 통해 양전하를 띤 나일론 멤브레인에 결합하여 고체 지지체에 블롯을

블로팅된 멤브레인을 차단 완충액으로 처리하여 비특이적 결합을 방지합니다. 다음으로, 항-5-메틸시토신 항체를 멤브레인에 추가하고 배양합니다. 이 항체는 DNA의 메틸화된 시토신에만 독점적으로 결합합니다.

결합되지 않은 항체를 세척하여 제거하고 1차 항체에 특이적으로 결합하는 화학발광 효소 접합 2차 항체를 추가합니다.

멤브레인에 화학발광 기질을 추가합니다. 항체의 효소는 기질과 반응하여 화학발광을 생성하여 다양한 강도의 점을 생성합니다.

멤브레인을 이미지화하고 각 샘플의 DNA 메틸화 정도에 해당하는 도트의 강도를 측정합니다.

된 DNA를 섭씨 95도에서 10분 동안 0.1몰 수산화나트륨에서 변성시켜 이 절차를 시작합니다. 얼음 위에 1몰 암모늄 아세테이트로 DNA를 중화시킨 후 이중증류수로 2배 희석한다.

도트 블롯에서 가장 중요한 단계는 샘플을 멤브레인에 스팟팅하는 것인데, 천천히 조심스럽게 수행합니다. 각 얼룩덜룩한 영역을 직경 3-4mm로 최소화하십시오.

입이 좁은 피펫 팁을 사용하여 그리드 중앙에 있는 양전하를 띤 나일론 멤브레인에 연속적으로 희석된 게놈 DNA 2마이크로리터를 조심스럽게 발견합니다. 멤브레인을 섭씨 80도에서 30분 동안 닦아냅니다. 다음으로, 10센티미터 페트리 접시에서 10센티미터 페트리 접시에서 1시간 동안 TBST의 5% BSA에 멤브레인을 담그고 부드럽게 흔들어 비특이적 항체 결합 부위를 차단합니다.

1시간 후 멤브레인을 TBST에서 매번 5분씩 세 번 세척합니다. 멤브레인을 마우스 항-5-메틸시토신 단클론 항체와 함께 TBST에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날 멤브레인을 TBST에서 매번 5분씩 세 번 세척합니다.

그런 다음 2차 항체인 양 냉이 과산화효소 접합 양 항마우스 면역글로불린 G와 함께 TBST에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이전과 같이 TBST에서 멤브레인을 세척한 후 멤브레인에 효소 기질을 첨가하고 5-10분 동안 배양합니다. 마지막으로 제조업체의 지침에 따라 화학발광 키트를 사용하여 2차 항체 신호를 시각화합니다.