피브린 응고 형성 모니터링을 위한 UV-Visible 분광법

상처에 대한 반응으로 일련의 효소 반응은 혈관을 밀봉하고 과도한 혈액 손실을 방지하는 불용성 단백질 네트워크(피브린 응고)의 형성을 시작합니다.

시험관 내에서 피브린 응고 형성을 모니터링하려면 응고 형성 완충액이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다. 완충액은 보조 인자인 칼슘 이온과 응고에 필수적인 가용성 당단백질인 피브리노겐으로 구성됩니다.

반응을 시작하는 단백질 분해 효소인 트롬빈으로 우물을 처리하십시오.

플레이트를 UV-가시광선 분광 광도계에 삽입합니다. 파장 350나노미터의 빛으로 우물을 비추고 일정한 간격으로 용액의 흡광도를 기록합니다.

처음에 입사광은 가용성 피브리노겐이 포함된 투명한 용액을 통과하여 최소한의 빛 흡광도와 최대 투과율을 나타냅니다. 검출기는 투과된 빛을 수집하고 용액의 탁도와 상관관계가 있는 시간 대비 흡광도를 보여주는 스펙트럼을 생성합니다.

시간이 지남에 따라 칼슘 이온 존재 하에서 트롬빈은 수용성 피브리노겐을 절단하여 피브린을 방출합니다. 이러한 불용성 피브린은 상호 작용하여 피브린의 3차원 네트워크(혈전)를 형성하여 용액을 탁하게 만듭니다. 피브린 응고를 함유한 탁한 용액은 더 많은 빛을 흡수하여 투과된 빛의 강도를 감소시킵니다.

UV-가시광선 스펙트럼을 분석합니다. 시간이 지남에 따라 흡광도 값의 증가는 용액의 탁도 증가와 상관관계가 있으며, 이는 빠른 피브린 응고 형성을 시사합니다.

200마이크로리터의 응고 형성 완충액에 새로 준비된 피브리노겐 1.5마이크로몰을 각 Aβ 음성 42 함유 및 대조군 웰에 첨가하고 실온에서 회전 플랫폼에서 플레이트를 배양합니다. 30분 후, 새로 준비된 트롬빈 용액 30마이크로리터를 각 피브리노겐 함유 웰의 중앙에 직접 동시에 첨가하여 혈전 형성을 시작하고, 즉시 350나노미터에서 체외 혈전의 흡광도를 판독하여 10분 동안 30-60초마다 측정을 반복합니다.