백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

트랜스웰 필터가 있는 유량 시스템에 연결된 사전 조립된 플로우 챔버를 가져 가십시오: 하나는 상단에 내피 단일 배양이 있고 다른 하나는 상단에 내피 배양이 있고 하단에 간질 세포가 있습니다.

두 챔버 모두 전염증성 사이토카인으로 전처리됩니다.

단일 배양에서 사이토카인은 내피 세포를 활성화하여 접착 분자 발현을 상향 조절합니다.

그러나 공동 배양에서 간질 세포와 내피 세포 사이의 혼선은 간질 세포가 전염증성 사이토카인에 대한 내피 세포의 반응을 하향 조절하는 조절 매개체를 생성하는 간질 세포로 이어집니다.

챔버를 반전 위상 대비 현미경 스테이지에 배치하십시오.

호중구 현탁액을 도입합니다.

호중구는 일시적인 접착 상호 작용을 통해 모집되어 내피 접착 분자에 결합하여 표면 결합 케모카인과의 상호 작용을 촉진하고 내피를 따라 굴러갑니다.

이 상호 작용은 호중구의 인테그린을 활성화하여 접착력을 안정화하고 내피 세포를 가로질러 이동을 초래합니다.

그러나 공동 배양에서 하향 조절된 내피 반응은 호중구 모집을 억제합니다.

흐름에서 호중구 모집을 평가하기 위해 위상차 현미경 하에서 배양을 시각화합니다.

필터 모델의 경우 먼저 금속 템플릿을 사용하여 파라필름 조각을 유리 커버슬립과 동일한 크기로 자릅니다. 그런 다음 금속 템플릿을 사용하여 파라필름에서 20 x 4mm 슬롯을 잘라 흐름 채널을 만듭니다. 파라필름 개스킷을 사용하여 유리 커버 슬립에 흐름 채널을 표시합니다. 유리 커버 슬립에 6웰 필터의 가장자리를 맞춥니다. 필터가 유동 채널 표시를 덮고 있는지 확인하십시오. 유형 10A 메스를 사용하여 필터를 조심스럽게 잘라냅니다.

그런 다음 파라필름 개스킷으로 필터를 조심스럽게 덮고 흐름 채널 슬롯이 필터 중앙에 있는지 확인합니다. 깨끗한 티슈를 사용하여 거품을 밀어냅니다. 이제 Perspex 흐름 챔버의 바닥판 홈에 커버슬립을 놓습니다.

상단 방풍 플레이트를 개스킷 상단 위에 놓고 플레이트를 함께 나사로 조입니다. 3방향 탭을 돌려 PBS-A 세척 완충액이 밸브를 통해 흐르도록 합니다. 그런 다음 압력계 튜브를 상단 방풍 플레이트의 입구 포트에 연결합니다. 기포가 통과할 수 있도록 흐름 채널을 통해 PBS-A를 실행합니다.

그런 다음 주사기 펌프의 압력계 튜브를 Perspex 플레이트의 출구 포트에 연결합니다. 챔버의 상판에 떨어진 PBS-A를 청소하십시오. 마지막으로, 챔버를 거꾸로 된 위상차 현미경의 스테이지에 놓고 초점을 조정하여 필터 위의 내피 세포를 시각화합니다.

내피 세포에 백혈구를 관류하려면 주사기 펌프를 다시 채우도록 설정하고 실행을 누릅니다. 내피 세포 단층을 시각화하도록 초점을 조정한 후 정제된 호중구 2밀리리터를 샘플 저장소에 넣고 2분 동안 데우십시오. 그런 다음 PBS-A로 내피를 2분 동안 세척합니다. 내피를 통해 호중구를 관류하려면 밸브를 켭니다. 호중구 볼루스를 4분 동안 전달합니다. 밸브를 끄고 나머지 실험 기간 동안 세척 저장소에서 PBS-A를 관류합니다.

실험을 수행할 때 내피 세포 단층을 파괴하고 부착된 호중구의 박리를 유발하므로 분석 중 기포가 통과하지 않도록 하십시오.

디지털 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 호중구 흐름 또는 관류 후 동안 호중구 모집을 기록합니다. 대물렌즈를 입구 포트의 채널 가장자리로 이동하고 포트의 중앙을 식별하여 채널의 중심을 식별합니다. 흐름 채널 중앙에 최소 5-10개의 필드를 모두 디지털 녹음합니다.

호중구 흐름 중에 기록하는 동안 1분 동안 10초마다 단일 필드의 이미지를 촬영합니다. 채널을 따라 이동하고 1분 동안 다른 필드를 기록하고 볼루스 기간 동안 이 과정을 반복합니다.

관류 후 기록을 위해 백혈구 행동을 평가하기 위해 흐름 채널 중앙에 5-10개의 필드를 10초 동안 기록합니다. 10초 간격 내에서 매초 이미지를 촬영합니다. 이를 통해 흐름에서 캡처하고 부착된 호중구의 거동을 분석할 수 있는 충분한 시간을 확보할 수 있습니다.

10개의 형질전환된 호중구를 포함하는 단일 필드를 5분 동안 기록하고 30초마다 이미지를 촬영합니다. 이것은 이동된 셀의 속도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 또 다른 일련의 10초 필드를 기록합니다. 이를 통해 호중구는 내피 단층을 통해 이동할 수 있습니다.

마지막으로 주사기 펌프를 멈추고 출구 튜브를 제거한 다음 입구 튜브를 제거합니다. 플로우 챔버를 분해하고 샘플 저장소를 PBS-A로 헹굽니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 백혈구 모집 및 행동 분석을 진행하기 전에 후속 필터 및 마이크로슬라이드 채널에 대해 반복합니다.