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무혈청 배지에서 후근 신경절 또는 DRG 조직으로 시작합니다. DRG 조직에는 세포외 기질인 ECM에 내장된 감각 뉴런과 위성 신경교세포가 포함되어 있습니다.
조직 접착력을 향상시키기 위해 젤라틴 단백질 혼합물로 코팅된 배양 접시에 파종합니다.
시간이 지남에 따라 신경교세포는 신경 확장을 허용하는 신경영양 성장 인자를 방출하여 DRG 외식편 배양을 확립합니다.
해리된 세포 배양을 개발하려면 이러한 DRG 외식편을 튜브에 넣으십시오. ECM을 분해하기 위해 콜라게나제로 치료한 다음 세포 연결을 방해하여 뉴런과 신경교세포를 방출하는 트립신으로 치료합니다.
효소 반응을 멈추기 위해 혈청이 풍부한 배지를 첨가하십시오.
내용물을 반복적으로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만들고 여과하여 잔해물을 제거합니다.
이 세포 현탁액을 원심분리하고 효소 함유 상청액을 제거합니다.
세포를 신경기저 배지에 재현탁하고 라미닌 코팅 플레이트로 옮깁니다.
위성 신경교세포와 감각 뉴런은 라미닌 코팅 플레이트에 부착되어 해리된 세포 배양을 확립합니다.
각 DRG를 건조한 유리 페트리 접시로 옮깁니다. 수술용 현미경으로 칼날을 사용하여 DRG에 여전히 부착된 과도한 섬유와 결합 조직을 청소하고 잘라냅니다. DRG는 백색 척수 신경을 따라 불룩하고 투명한 구조로 쉽게 식별할 수 있으며 혈관은 종종 DRG 주변에서 발견됩니다.
그런 다음 DRG에 세척된 것을 얼음처럼 차갑고 무혈청 배지가 들어 있는 새 페트리 접시에 넣습니다. 젤라틴 단백질 혼합물을 얼음처럼 차갑고 무혈청 배지에 1:1 비율로 희석합니다. 그런 다음 10 또는 20마이크로리터의 젤라틴 단백질 혼합물로 미리 코팅된 12웰 플레이트에 DRG를 생체 외 플레이트에 플레이트하고 섭씨 37도에서 30-60분 동안 보관합니다.
이제 1.5-2밀리리터의 무혈청 배지를 배양 시스템에 부드럽게 첨가하여 전체 외식편을 덮고 외식편을 배양 조건으로 유지합니다. 72시간마다 DRG 성장 배지를 교체합니다. 필요한 만큼 DRG가 성장하도록 합니다.
DRG는 젤라틴 단백질 혼합물을 사용하여 유리판에 고정되기 때문에 이는 중요한 단계입니다. 따라서 부유를 방지하려면 중합 시간과 피펫팅 기술이 중요합니다.
이 절차에서는 수집된 모든 DRG를 콜라게나제 IV를 함유한 F12 배지가 있는 1.5밀리리터 멸균 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 콜라게나제 IV가 포함된 신선한 배지를 교체하고 샘플을 45분 더 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 0.025% 트립신을 함유한 F12 배지 2밀리리터로 30분 동안 외식편을 처리합니다.
콜라게나제 IV 처리 직후, 소 태아 혈청을 함유한 F12 배지 2밀리리터와 함께 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 2밀리리터의 F12 배지로 외식편을 세 번 세척하고 배지가 흐려질 때까지 유리 피펫으로 기계적으로 해리합니다.
그런 다음 0.22마이크로미터 필터를 통해 해리된 세포 배양물을 여과하여 불순물과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 여과된 세포 용해물을 2분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 500마이크로리터의 신경-기저 배지에 재현탁합니다. 해리된 세포를 선호하는 세포 밀도로 라미닌 코팅 커버슬라이드에 놓습니다.
