선정 Plasmodium falciparum 기생충

이 절차의 전반적인 목표는 인간의 뇌 내피 세포에 결합할 플라스모듐, fpar 및 기생충을 선택하는 것입니다. 이것은 먼저 감염된 적혈구와 감염되지 않은 적혈구의 혼합물을 포함하는 plasmodium, fpar 및 기생충 배양과 인간 뇌 내피 세포 층을 배양하여 달성되며, 다음 단계는 배양물로 여러 번 세척하여 감염되지 않고 결합되지 않은 적혈구를 씻어내는 것입니다. 그런 다음 중간 정도의 신선한 적혈구를 첨가하여 기생충 개체군을 더 성장시킬 수 있습니다.

몇 주 후의 마지막 단계는 충분한 paras에 도달하는 즉시 전체 선택을 반복하는 것입니다. 궁극적으로 현미경 검사는 HBE five i에 결합된 많은 양의 기생충을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 세포 지구력 과정에 관여하는 기생충 리간드 또는 숙주 수용체 분자의 식별과 같은 뇌 말라리아 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

고갈 필터를 통과하여 백혈구에서 적혈구를 분리하여 그룹 O 양성 전혈에서 인간 적혈구를 준비합니다. 1000G에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 Reese는 모든 PMI와 함께 펠릿을 사용합니다. 불완전, 중간.

이 세척 단계를 한 번 더 반복한 다음 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 50% 헤마토크릿의 PMI 불완전 배지에서 적혈구는 일주일 동안 섭씨 4도에서 보관됩니다. 배양 Odium Valspar는 적혈구를 감염시켰습니다.

RPMI를 사용하면 2% 헤마토크릿에서 배지를 완성하고 매일 3% 이산화탄소, 1% 산소 및 96% 질소로 섭씨 37도에서 배양합니다. 기생충의 발달 단계를 평가하기 위해 보석 얼룩을 만드십시오. 500G에서 5분 동안 배양물을 회전시켜 매일 배지를 교체하십시오.

상층액을 흡입하고 일주일에 한 번 정도 새로운 RPMI 완전 배지를 추가합니다. 수성 5%D 소르비톨로 처리하여 기생충을 동기화합니다. 선택 분석은 최소 5%에서 10%의 Parsit를 관찰한 고리 단계 배양 다음 날에 수행할 수 있습니다.

또한. 5개의 안구 세포 60mm 접시당 30마이크로리터의 P 세포 부피를 형성하기에 충분한 기생충 배양이 필요합니다. 60mm 조직 배양 접시를 준비하여 접시에 피브로넥틴과 멸균 식염수를 제곱센티미터당 2마이크로그램을 첨가하여 인간의 뇌 미세혈관 내피 세포주 또는 H back fivei를 받습니다.

접시를 섭씨 37도에서 5-20분 동안 배양한 다음 피브로넥틴 용액을 흡입합니다. 그런 다음 이온화 및 원심분리 Reese에 의해 25cm 정사각형 조직 플라스크에서 HBE 5개의 I 세포를 수확하고 세포 펠릿을 10ml의 DMEM, 완전한 배지에 현탁시킵니다. 그런 다음 이 세포 현탁액 1.5ml를 피브로넥틴 처리된 조직 배양 접시에 추가하고 배양액이 50 - 100% co에 도달할 때까지 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 2-3일 동안 배양하고 기생충 배양이 분석 당일에 cyto aian에 대해 준비됩니다.

HBE five I 문화는 50%에서 100% 유창해야 합니다. 기생충 배양은 착색된 영양동물(trophozoites) 단계에 있어야 하며, 적어도 5-10%의 파라와 2%의 헤마토크릿이 있어야 합니다. 먼저 배양 플라스크에서 1.5ml의 기생충 배양을 피펫팅하고 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

500G에서 5분 동안 배양물을 원심분리하고 10ml로 다시 구부립니다. 갓 만든 따뜻한 DMEM 불완전, 미디엄. 최종 원심분리가 완료된 후 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.

Asberry DMEM 불완전, 중간 및 재 DMEM 1.5 밀리리터에 30 마이크로 리터 펠릿을 소비합니다. 불완전한 배지, 1%BSA가 보충되었습니다. 다음으로 hvac의 60mm 접시를 검색합니다. 5.

안구 세포는 배양 배지를 흡인하고 3ml의 DMEM으로 두 번 세척합니다. 불완전한 매체입니다. 기생충 용액, HPE 5개의 안구 접시를 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 총 75분 동안 배양합니다.

부화 resus하는 동안 두 번, 부화 후 접시를 부드럽게 흔들고 휘젓는 방식으로 기생충을 매달아 놓습니다. 플라스틱 파스타 피펫을 사용하여 배지를 흡입하여 따뜻한 DMEM 불완전 배지 3ml를 추가하여 접시를 5번 세척한 다음 최종 세척 후 접시를 부드럽게 흔든 다음 도립 현미경으로 접시를 검사합니다. 감염되지 않은 적혈구가 여전히 많이 보이면 위에서 설명한 대로 세척 절차를 반복하여 제거하십시오.

접시에서 배지를 흡인 한 후 Resus는 40 마이크로 리터의 신선한 적혈구 포장 세포 부피를 현탁 예열 된 RPMI에서 배지를 완성하고 세포 현탁액을 접시에 추가합니다. 접시를 공기 조준경 배양실에 놓습니다. 그런 다음 접시에 3 % 이산화탄소, 1 % 산소 및 96 % 질소를 3 분 동안 가스로 만듭니다.

그리고 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 놓습니다. 이 잠복기 동안, 무대 위의 분열분열 기생충이 터지고 마이트가 적혈구를 다시 주입한다. 다음날, 고리 단계의 기생충을 씻어서 수확합니다.

RPMI를 사용하면 이전과 유사한 방식으로 불완전한 매체를 사용할 수 있지만 더 격렬한 매체 피펫팅과 플레이트가 흔들립니다. 사용된 모든 배지는 15ml 원추형 튜브에 재현탁된 적혈구를 포함하고 있습니다. 접시 원심분리기에서 모든 적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 도립 현미경으로 플레이트를 확인하십시오.

기생충을 펠릿화하기 위해 세척된 플레이트의 매체를 담고 있는 튜브는 상등액인 Resus를 버리고 5ml를 현탁시킵니다. RPMI는 배지를 완성하고 배양을 위해 혼합물을 25cm 정사각형 플라스크에 놓습니다. 기생충은 충분한 물질이 얻어지고 새로운 선별 라운드가 수행될 때까지 2-4주 동안 배양됩니다.

선택되지 않은 HB 3 기생충은 hbe 5 개의 안구 세포에 대한 낮은 수준의 결합을 보여줍니다. 이 이미지는 2%글루타르알데히드로 고정되고 giemsa로 염색된 5개의 안구 세포를 보여주며, 감염되지 않은 적혈구와 결합되지 않은 감염된 적혈구를 씻어낸 후 복숭아를 1000배 확대하여 현미경으로 시각화했습니다. 각 선별 라운드가 끝나면 점점 더 많은 기생충이 내피 세포에 결합하고 5 라운드의 선택 후 더 짧은 시간 간격으로 선택을 반복 할 수 있습니다.

높은 결합 기생충 집단은 HB 3 개의 HBE 기생충과 함께 여기에서 볼 수 있듯이 얻어집니다. 이 표는 HE 5에 결합하기 위해 성공적으로 선택된 plasmodium alspar 균주에 대한 요약을 보여줍니다. HB 3은 5 라운드의 선택 후 TNF 활성화 HE 5 I에서도 선택되었습니다.

DD 2 균주는 선택되지 않은 DD 2에 비해 HBE 5 I에 대한 결합의 증가를 나타내지 않았습니다. 이 400배 확대 이미지는 선택 전에 plasmodium alspar HB 3 기생충이 HD MEK 피부 내피 세포에 결합하는 것을 보여줍니다. 여기서, plasmodium alspar HB 3 기생충이 동일한 피부 내피 세포주에 결합하는 것은 4 차례의 선택 후에 나타납니다.

이 그림은 선택 전에 plasmodium spar HB 3 기생충이 HP ME 폐 내피 세포에 결합하는 것을 보여줍니다. 이제 plasmodium spar HB 3 기생충의 H HP ME 세포에 대한 결합이 4 라운드의 선택 후에 증가합니다. hd e, C 및 H HP EC에 대한 배양 배지는 약간 다르지만, 선택에 사용된 프로토콜은 hbe five I.와 동일했습니다.R-T-P-C-R 또는 마이크로 분석과 같은 방법의 이 절차에 따라 선택되지 않은 기생충 및 선택된 기생충에서 변이 표면 항원의 전사를 특성화하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.