선정 Plasmodium falciparum 기생충

이 프로시저의 전체적인 목적은 인간 뇌 혈관 내피 세포에 결합하는 plasmodium, fpar 및 기생충을 선택하는 것입니다. 이는 먼저 감염된 적혈구와 감염되지 않은 적혈구가 혼합된 plasmodium, fpar 및 기생충 배양액을 인간 뇌 혈관 내피 세포 층과 함께 배양함으로써 수행됩니다. 다음 단계로, 배양 배지로 여러 번 세척하여 감염되지 않았거나 결합하지 않은 적혈구를 씻어냅니다. 그 후, 기생충 군집이 추가로 성장할 수 있도록 신선한 적혈구를 첨가합니다.

몇 주 후의 마지막 단계는 충분한 파라사이트(paras) 수에 도달하는 즉시 전체 선택 과정을 반복하는 것입니다. 최종적으로, 현미경 관찰을 통해 HBE five i에 결합된 다량의 파라사이트를 확인합니다. 이 방법은 사이토엔듀런스(cyto endurance) 과정에 관여하는 파라사이트 리간드 또는 숙주 수용체 분자의 식별과 같이 뇌성 말라리아 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

백혈구 제거 필터에 통과시켜 전혈 O형 양성에서 적혈구를 백혈구로부터 분리하여 인간 적혈구를 준비합니다. 세포를 1000 G에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿을 PMI Incomplete medium으로 현탁합니다.

이 세척 단계를 한 번 더 반복한 후, 펠렛을 재현탁합니다. 50% hematocrit의 PMI 불완전 배지에서 적혈구를 4°C로 일주일 동안 보관합니다. Odium Valspar에 감염된 적혈구를 배양합니다.

2% hematocrit이 포함된 RPMI 완전 배지를 사용하여 37°C, 3% CO₂, 1% O₂, 96% N₂ 조건에서 매일 배양합니다. 기생충의 발달 단계를 평가하기 위해 Giemsa 도말 표본을 제작합니다. 매일 500 ×g에서 5분간 원심 분리하여 배지를 교체합니다.

약 일주일에 한 번씩 상층액을 흡입하여 제거하고 신선한 RPMI 완전 배지를 추가합니다. 5% 수용성 sorbitol 처리를 통해 기생충을 동기화합니다. 링 단계(ring stage) 배양액에서 최소 5% 내지 10%의 Parsit이 관찰되는 다음 날에 선택 분석을 수행할 수 있습니다.

추가적으로, hbe five eye 세포가 담긴 60 millimeter 디쉬당 30 microliter의 P 세포 부피를 형성할 수 있을 만큼 충분한 기생충 배양액이 필요합니다. 60 millimeter 조직 배양 디쉬에 2 micrograms/cm²의 fibronectin과 멸균 식염수를 첨가하여 인간 뇌 미세혈관 내피세포주(H back fivei)를 배양할 준비를 합니다.

디쉬를 37°C에서 5~20분 동안 배양한 후, 피브로넥틴(fibronectin) 용액을 흡입하여 제거합니다. 그다음, 이온화 및 원심분리를 통해 25 cm² 조직 배양 플라스크에서 HBE 5-IMM 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 10 mL의 DMEM 완전 배지에 현탁합니다. 이 세포 현탁액 1.5 mL를 피브로넥틴 처리된 조직 배양 디쉬에 첨가하고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 2~3일 동안 배양하여 세포 합류도(confluency)가 50~100%에 도달할 때까지 유지합니다. 분석 당일에 배양된 세포를 사용하여 사이토카인 분석을 수행할 준비를 마칩니다.

HBE five I 배양물은 50에서 100%의 합류도(confluency)를 유지해야 합니다. 기생충 배양물은 색소성 트로포조이트(pigmented trophozoites) 단계여야 하며, 최소 5~10%의 기생충 비율과 2%의 헤마토크릿(hematocrit) 수치를 가져야 합니다. 먼저 배양 플라스크에서 기생충 배양물 1.5 milliliters를 피펫으로 취해 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

배양물을 500 G에서 5분 동안 원심분리하고 10 milliliters의 갓 제조한 따뜻한 DMEM 불완전 배지로 다시 현탁하십시오. 최종 원심분리가 완료된 후 이 세척 단계를 한 번 더 반복하십시오.

DMEM 불완전 배지를 사용하여 30 µL 펠렛을 1% BSA가 첨가된 1.5 mL의 DMEM 불완전 배지에 재현탁합니다. 다음으로, hVac.Five가 담긴 60 mm 디쉬를 꺼냅니다.

안구 세포의 배양액을 흡입하여 제거하고 3 mL의 DMEM(불완전 배지)으로 2회 세척합니다. 기생충 용액을 HPE-5 안구 세포가 담긴 디쉬에 첨가하고, 조직 배양 배양기에서 총 75분 동안 배양합니다.

배양 과정 중 두 번, 배양이 끝난 후 디쉬를 부드럽게 흔들어 기생충을 현탁시키십시오. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 배지를 흡입하고 3 mL의 따뜻한 DMEM 불완전 배지를 추가하는 방식으로 디쉬를 다섯 번 세척하십시오. 마지막 세척 후 플레이트를 부드럽게 흔든 다음, 도립 현미경으로 디쉬를 관찰하십시오. 감염되지 않은 적혈구가 여전히 많이 보인다면, 앞서 설명한 세척 과정을 반복하여 이를 제거하십시오.

디쉬에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 신선한 적혈구 농축액(packed cell volume) 40 µL를 가온된 RPMI 완전 배지에 재현탁하고, 이 세포 현탁액을 디쉬에 첨가합니다. 디쉬를 기밀 배양 챔버에 넣습니다. 그런 다음 3% carbon dioxide, 1% oxygen 및 96% nitrogen 가스로 3분 동안 처리합니다.

그 후 챔버를 37 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 이 배양 과정 동안 분열기(schizont stage) 기생충이 터지고 메로조이트(merozoites)가 적혈구를 다시 침입합니다. 다음 날, 세척을 통해 링 단계(ring stage) 기생충을 수확합니다.

이전과 유사한 방식으로 RPMI 불완전 배지를 사용하여 세척하되, 배지를 피펫팅하고 플레이트를 흔드는 과정을 더 강하게 수행합니다. 재부유된 적혈구가 포함된 모든 사용 배지를 15 milliliter 원추형 튜브에 보관하십시오. 도립 현미경으로 플레이트를 확인하여 원심분리 튜브에서 모든 적혈구가 제거되었는지 확인합니다.

세척된 플레이트에서 얻은 배지가 담긴 튜브를 원심분리하여 기생충을 펠릿화한 후 상층액을 제거합니다. 5 mL의 RPMI 완전 배지를 넣어 재현탁하고, 혼합물을 25 cm² 플라스크에 옮겨 배양합니다. 충분한 양의 시료가 확보되어 새로운 선택 과정을 수행할 수 있을 때까지 기생충을 2~4주 동안 배양합니다.

선별되지 않은 HB three 기생충은 hbe five eye 세포에 대해 낮은 수준의 결합력을 보입니다. 이 이미지는 2% glutaraldehyde로 고정하고 giemsa로 염색한 hbe five eye 세포를 현미경 하에서 1000배 배율로 관찰한 것입니다. 사진은 감염되지 않은 적혈구와 결합하지 않은 감염 적혈구를 세척하여 제거한 후 촬영되었습니다. 선별 회차가 반복될수록 더 많은 기생충이 내피 세포에 결합하며, 5회 선별 후에는 더 짧은 시간 간격으로 선별을 반복할 수 있습니다.

HB three HBE 기생충을 사용하여 여기에서 보여주는 것과 같이 높은 결합력을 가진 기생충 집단을 확보합니다. 이 표는 HE five에 결합하도록 성공적으로 선택된 plasmodium alspar 균주들의 요약본을 보여줍니다. HB three는 5라운드의 선택 과정 후 TNF 활성화된 HE five I에서도 선택되었음을 참고하시기 바랍니다.

DD two 균주는 비선별된 DD two와 비교했을 때 HBE five I에 대한 결합력 증가를 보이지 않았습니다. 400배 배율의 이 이미지는 선별 전 plasmodium alspar HB three 기생충이 HD MEK 진피 내피 세포에 결합한 모습을 보여줍니다. 여기서는 4 rounds의 선별 과정 후에 동일한 진피 내피 세포주에 결합한 plasmodium alspar HB three 기생충의 모습이 나타나 있습니다.

이 그림은 선택 전 plasmodium spar HB three 기생충의 HP ME 폐 내피 세포 결합 상태를 보여줍니다. 이제 4라운드의 선택 과정을 거친 후 H HP ME 세포에 대한 plasmodium spar HB three 기생충의 결합이 증가했습니다. hd e, C 및 H HP EC의 배양 배지는 약간 다르지만, 선택에 사용된 프로토콜은 hbe five I와 동일했습니다. 이 절차 이후에 RT-PCR 또는 미세 분석과 같은 방법을 수행하여, 선택되지 않은 기생충과 선택된 기생충에서 변이 표면 항원의 전사를 특성화하는 것과 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.