Caenorhabditis elegans 뉴런에 대한 살충제의 영향 연구

뉴런에서 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 발현하는 형질전환 Caenorhabditis elegans가 포함된 한천 플레이트로 시작합니다.

접시에 멸균수를 넣고 소용돌이쳐 벌레를 들어 올린 다음 튜브로 옮깁니다.

벌레가 가라앉도록 한 다음 여분의 물을 제거하고 다시 현탁시킵니다.

재현탁된 벌레를 살충제 코팅 플레이트와 살충제가 없는 대조군 플레이트로 옮긴 다음 배양합니다.

그들의 작용에 따라 살충제는 특정 뉴런을 특이적으로 손상시키고 뉴런 부종을 유발하여 GFP 발현을 감소시킵니다.

마취제가 들어 있는 아가로스 패드에 벌레를 옮긴 다음 커버슬립을 놓습니다.

슬라이드를 형광 현미경에 장착합니다. 먼저 위상차 모드를 사용하여 웜을 시각화한 다음 형광 모드로 전환합니다.

살충제 처리된 벌레에서 뉴런은 형광 감소, 체세포 부종, 신경 과정의 틈을 나타내며 이는 신경퇴행성 효과를 나타냅니다.

통제하는 동안 건강한 뉴런은 밝은 형광을 발하는 온전한 체세포를 보여줍니다.

마이크로피펫 장소를 사용하여 멸균수 1밀리리터를 선충 접시에 올려 놓습니다. 다음으로 선을 들어 올리기 위해 물을 휘젓습니다. 그런 다음 선충이 있는 액체를 1.5밀리리터 미세분리기 튜브로 제거합니다. 10분 후 선충이 중력에 의해 가라앉으면서 최소 500마이크로리터의 물을 조심스럽게 제거하고 버립니다.

그런 다음 선충을 재현탁하고 절단된 노란색 피펫 팁을 사용하여 각 처리 플레이트에 50-100마이크로리터의 부유 벌레를 제거하여 각 플레이트에 최소 10마리의 성충이 있는지 확인합니다. 슬라이드의 한쪽에만 라벨 테이프 조각을 놓아 두 개의 슬라이드를 준비하여 균일한 두께의 패드를 형성합니다.

그런 다음 벤치탑의 깨끗하고 사용하지 않은 슬라이드를 그 사이에 놓습니다. 마이크로피펫터를 사용하여 녹인 아가로스 10마이크로리터 방울을 슬라이드 중앙에 놓습니다. 그런 다음 방울이 있는 슬라이드에 수직으로 또 다른 깨끗한 슬라이드를 위에 놓아 방울을 평평하게 하고 압력을 가하여 아가로스 방울이 라벨링 테이프의 두께를 형성하도록 합니다.

그런 다음 일정한 압력을 가하여 두 슬라이드를 분리합니다. 그런 다음 한천 면이 위로 향하도록 슬라이드를 벤치탑에 올려 놓고 사용하기 전에 1-2분 동안 건조시킵니다. 아가로스 패드로 준비된 슬라이드에 선충류를 추가하려면 아지드나트륨 1몰이 함유된 5마이크로리터의 물 방울을 한천 패드에 추가하면 벌레를 마취하고 동원합니다.

그런 다음 웜 픽을 사용하여 처리 슬라이드당 최소 10개의 선충류를 액적으로 옮기고, 선충을 옮기기 전후에 멸균해야 합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 커버슬립을 비스듬히 놓고 천천히 내려 추가합니다.

그런 다음 준비된 습식 마운트를 형광 현미경에 올려 먼저 10배 배율 및 위상차, 그 다음 위상차 및 형광 조명으로 40배 배율로 웜을 관찰합니다.

준비된 젖은 마운트를 현미경 스테이지에 한 번에 하나씩 놓고 현미경 스테이지 클립을 사용하여 제자리에 고정합니다. 그런 다음 일반적으로 10배인 가장 낮은 배율 대물렌즈로 습식 마운트를 보기 시작합니다. 그리고 밝은 필드 또는 위상차를 사용하여 선충을 시각화하고 초점을 맞춥니다.

선충이 시야에 위치하면 현미경의 미세 초점 손잡이를 사용하여 선충에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 다이얼을 돌려 조명을 형광으로 전환하고 빛을 카메라로 향하게 하여 디지털 이미지를 캡처합니다.

다음으로, 이미징 소프트웨어를 사용하여 조명을 조정하여 뉴런이 밝게 비추되 과포화되지 않도록 합니다. 어느 시점에서 셀 이미지와 동일한 배율로 눈금자의 별도 이미지를 얻어 그림에 대한 배율 척도를 제공합니다.