간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

이 절차의 전반적인 목표는 간 세포의 세포내 활성을 평가한 다음 플라스틱 접시에서 배양할 수 있는 생존 가능한 간, 사인파 내피 세포의 순수한 집단을 분리하는 것입니다. 이것은 살아 있는 동물의 간을 캐뉼레이션 및 절제하고 소금 완충 용액으로 간을 씻어내어 혈액을 제거함으로써 이루어집니다. 그런 다음 간의 세포는 내재화를 위해 표지된 리간드에 노출됩니다.

다음 단계는 콜라겐분해효소로 간을 소화하여 현탁액 상태의 간 세포 혼합물을 생성하는 것입니다. 다음으로 perol gradient를 사용한 차등 원심분리는 성상 세포, 작은 간세포, 잔여 혈액 세포 및 세포 파편에서 sec를 분리하는 데 사용됩니다. 마지막 단계는 유리에 접착하여 쿠퍼 셀에서 secs를 분리하는 것입니다.

결국, 리간드 흡수를 위해 분석하거나 다운스트림 응용 분야를 위해 배양할 수 있는 실행 가능한 정제된 sec를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 간 내피 세포의 역할과 혈액 내 거대분자의 제거 또는 간 손상, 지방간 질환, SSIS, 섬유증 및 노화와 같은 다양한 생리학적 상태에 대한 반응과 같은 간 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 불멸화된 다른 간 세포와 달리 분화된 간 정현파 내피 세포주는 존재하지 않습니다.

따라서 이러한 일차 세포는 동물에서 직접 유래해야 합니다. 오늘 소개할 절차는 원심분리 및 루션과 같은 자본 장비를 사용하지 않고 간 정현파 내피 세포를 정제하는 것입니다. 우리가 보여줄 절차는 단기 배양 방식으로 세포를 채취하는 것과 관련이 있으며, 전체 절차에서 멸균 기술을 사용하지 않을 것입니다.

그러나 장기 배양을 사용하려면 멸균 기술을 사용하고 생물 안전 캐비닛을 사용합니다. 봉합사의 조임과 함께 카테터를 배치하고 간을 절단하지 않고 동물로부터 간을 채취하고 카테터를 분리하는 것이 중요하기 때문에 이 절차를 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 콜라겐 분해 효소의 무게를 측정하고 얼음 위에 올려 실험을 준비합니다.

그런 다음 TBS를 데우고 산소를 공급하고 필요한 도구를 준비합니다. 다음으로, 200g의 쥐를 선택하여 불소 챔버에서 깊이 마취시킵니다. 70% 에탄올로 복부 복부를 적셔 마취를 확인합니다.

반응이 없으면 가위와 집게를 사용하여 복강을 열어 최상의 결과를 얻으십시오. 간을 데치는 다음 단계는 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 문맥을 찾아 장간막 가지 바로 위의 정맥 아래에 두 개의 봉합사를 놓습니다.

이제 18게이지 카테터로 정맥을 캐뉼레이션합니다. 카테터를 막는 바늘은 실의 고리를 몇 밀리미터 넘어 바늘을 놓아야 하며, 그래니 또는 스퀘어 매듭이라고도 하는 두 개의 오버핸드 매듭으로 봉합사를 조여야 합니다. TBS가 있는 간에서 혈액을 10분 이상 씻어내지 마십시오.

간이 홍조되는 동안 주요 동맥 중 하나를 절단하십시오. 위장관과 결합 조직을 잘라내어 간을 절제합니다. 절제된 간을 체액의 재순환이 가능한 깔때기 위에 놓되 아직 체액을 50밀리리터로 재순환시키지 않습니다.

작은 비커에 담긴 RPMI 미디어. 최종 농도에 0.05%BSA 및 0.01밀리큐리의 방사 표지된 헤파린 또는 기타 적절하게 표지된 리간드를 추가합니다. 세포내이입의 경우, 산소화가 가능하도록 이 be를 장치에 부착하십시오.

펌프를 끄고 흡입구 튜브를 전환한 다음 분당 20밀리리터로 펌프를 켭니다. 라벨이 붙은 RPMI가 간에 접근하면 펌프를 끄고 깔때기와 튜브에 있는 과도한 액체가 배출되도록 합니다. 배수 튜브를 미디어 비커에 삽입하여 라벨이 지정된 미디어의 재순환을 허용한 다음 펌프를 다시 시작합니다.

체액이 간을 통해 재순환되도록 1시간 이상 하지 마십시오. 이 내재화 단계에서는 간을 덮어 간의 온도가 안정적인지 확인하고 리간드의 세포내이입(endocytosis)을 종결하기 위해 콜라겐분해효소를 소화할 수 있도록 준비합니다. 간은 콜라겐분해효소 소화를 준비하기 위해 결합되지 않은 리간드의 간 정현파를 제거하기 위해 2분 동안 TBS로 다시 플러시됩니다.

TBS로 다시 플러싱하는 2분 동안 사전 계량된 콜라겐 분해 효소 A를 0.45 마이크로몰의 농도로 완충액 2에 용해시키고 간을 세척한 직후 용액을 여과하고 펌프를 끄고 유체를 콜라겐 분해 효소에서 플러시하도록 전환합니다. A는 동일한 흐름에서 재순환으로 플러싱을 시작합니다. 콜라겐분해효소 분사 후 최대 몇 분 동안 섭취하십시오.

관류. 카테터를 제거하고 간을 접시에 옮깁니다. 겸자를 사용하여 완충기 1개를 포함하고, 간의 캡슐을 후에 벗기고 액체에서 세포를 밖으로 동요하십시오.

액체가 불투명해지면 100미크론 메쉬를 통과한 다음 30미크론 메쉬를 통과한 다음 50ml 원추형 실린더에 넣습니다. 실온에서 접시에 완충액을 더 넣고 더 많은 간 세포를 기계적으로 해리합니다. 그런 다음 필터로 옮깁니다.

적당한 흔들기로 세포를 제거할 수 없을 때까지 이 과정을 계속합니다. 먼저 세포를 씻어내고 세포가 창백해질 때까지 150배 G로 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 비실질 세포를 함유한 S 나틴을 얼음 위의 50ml 원뿔형으로 옮기고 펠릿을 40ml에 재현탁합니다.

버퍼 1. 버퍼 3에서 세척 과정을 두 번 반복하여 최소 97% 간세포인 펠릿을 만들어 최소 95% 순수 원심분리기인 S secs의 모집단을 얻고, 섭씨 4도에서 10분 동안 200배 G에서 슈퍼 나틴의 원뿔형을 얻습니다. 그런 다음 액체를 버리고 모든 세포 펠릿을 섭씨 4도에서 R-P-M-I-B-S-A 5ml에 현탁시킵니다.

세포를 두 개의 튜브로 당기고 튜브에 R-P-M-I-B-S-A를 35ml까지 채웁니다. 이제 3 분 동안 100 배 G에서 세포를 원심 분리하고 secs를 포함하는 상등액의 상단 25 밀리리터를 얼음 위의 50 밀리리터 원뿔로 옮깁니다. 그런 다음 나머지 10ml의 매체에 펠릿을 다시 현탁시키고 25ml의 차가운 R-P-M-I-B-S-A 용액을 추가합니다.

세척 단계를 한 번 반복하여 secs와 함께 S natin을 두 개 더 수집합니다. 지금 분리기는 200 시간 G에 10 분 동안 4 섭씨 온도 도중 상층액 수집을 원심 분리한다. PBS에서 통화당 25%의 20밀리리터로 원뿔형 3개를 채웁니다.

얼음 위에 올려 놓고 밑받침으로 그라디언트를 설정하십시오. 각 튜브에서 15 % 50 밀리리터. 총 30 밀리리터, RPMI와 BSA로 세포를 재현탁시키고 이들을 결합한 다음 각 그래디언트를 10 밀리리터의 결합된 세포 현탁액으로 조심스럽게 오버레이합니다.

섭씨 4도에서 20분 동안 900배 G로 그라디언트를 원심분리하는데, 이는 secs와 cofer cell이 25 50% 인터페이스 흡인 25 50% 인터페이스에 있기 때문입니다. 이것은 성상 세포를 제거하고, 이제 25 50% 계면의 세포를 수집하고, 이를 약 40밀리리터의 최종 부피로 차가운 RPMI가 있는 원뿔형으로 옮깁니다. 이것은 호출당 원심분리기, secs 및 fer 셀을 섭씨 4도에서 10분 동안 350배 G로 희석합니다.

펠릿을 약 10밀리리터의 사전 경고된 수정되지 않은 상태로 재현탁시킵니다. RPMI는 현탁액을 페트리 접시 또는 결정화 접시로 옮기고 섭씨 37도에서 15분 동안 접시를 배양합니다. 배양 후, 접시를 부드럽게 저어주고 상등액에 secs를 모으십시오.

쿠퍼 세포는 유리에 부착되었을 것이고, secs는 접시에 부착된 세포로부터 변형된 RPMI 배지 세포 용해물을 가진 피브로넥틴 코팅된 플레이트에서 배양될 수 있으며, 현탁액에 남아 있는 세포는 SDS 페이지로 분리하고 CD 1 63 마커를 포함하는 안티 CD 1 63 항체 쿠퍼 세포로 프로브하고, 이에 고착되지 않은 유리 세포에 부착함으로써 CCS로부터 분리하였다. 유리는 피브로넥틴 코팅 플라스틱에 도금되었습니다. 6 개의 우물 요리와 밤새 배양. RPMI에 0.1%BSA와 연쇄상구균이 추가되었습니다.

현미경 검사와 같은 위상차 하에서 secs는 in vivo 아키텍처를 연상시키는 매우 평평한 세포질 형태를 나타냅니다. S 스탈린 두 수용체의 두 동형에 대한 단클론 항체. SEC 분화의 마커는 개요 프로토콜을 사용하여 수집된 간세포, 용해물 및 CCS를 조사하는 데 사용되었습니다.

예상대로 secs는 stepin에게 긍정적이었습니다. 2. 이전 실험에서는 헤파린의 카르복실레이트 그룹에 비오틴 태그가 부착된 헤파린을 주입했습니다. 이당류는 주사 후 30분 동안 요오드화 스트렙타비딘에 접합되었습니다.

간은 이 절차를 사용하여 표지된 헤파린을 제거하는 주요 기관이었습니다. 이 비디오에서는 라벨링된 헤파린의 대다수가 secs에 의해 내재화되어 있음을 보여줍니다. 간세포와 대조적으로, 이러한 내재화 사건은 세포가 원래 상태에 있는 온전한 간 내에서 발생했습니다.

따라서 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 동물에서 간 정현파 내피 세포를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 24시간에서 48시간 이내에 이러한 세포를 사용하는 것이 중요하다. 간으로서 정현파 내피 세포는 배양에서 매우 짧은 시간에 본능적인 특성을 잃습니다.