In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

다리로부터 입력을 받는 감각 뉴런 세포체의 클러스터인 노출된 후근 신경절 또는 DRG가 있는 마취된 형질전환 마우스를 예로 들어 보겠습니다.

DRG의 뉴런은 세포질 칼슘 지표를 발현합니다.

공초점 현미경을 사용하여 DRG를 시각화하여 많은 수의 뉴런의 집단 활동을 이미지화합니다.

외부 자극이 없으면 낮은 세포내 칼슘 수치로 인해 지표가 기본 형태로 유지되어 희미한 기준선 형광이 발생합니다.

뒷발에 기계적 또는 열적 자극을 가하여 감각 뉴런에 활동 전위를 생성합니다.

신호는 뉴런의 전압 개폐 칼슘 채널이 열리는 DRG로 전파되어 칼슘 유입이 가능합니다.

추가 칼슘 이온은 지시약에 결합하여 형광 강도를 증가시키는 구조 변화를 유도합니다.

칼슘 유입을 나타내는 자극된 뉴런의 수에 해당하는 강도로 DRG에서 밝은 형광을 관찰합니다.

온을 섭씨 37도로 유지하기 위해 가열된 패드 위에 마우스를 놓습니다. 쥐의 골반 뼈를 느껴 요추 확대를 찾습니다. 그런 다음 요추 확대 부위 위의 마우스 등을 면도합니다. 가위를 사용하여 요추 확대 부위 위에 3면 직사각형 절개를 하고 집게로 피부를 접습니다.

13mm 스프링 해부 가위를 사용하여 척추 오른쪽에 3-4mm 절개를 합니다. 가위를 사용하여 피부와 근육을 옆으로 잘라 척추를 노출시킵니다. 그런 다음 8mm 가위를 사용하여 근육과 결합 조직을 잘라 오른쪽 L5 DRG의 가로 돌기를 청소합니다.

면이나 젤 폼을 사용하여 혈액을 흡수하여 출혈을 최소화하십시오. DRG에 닿지 않도록 주의하면서 Friedman-Pearson rongeurs 또는 강한 미세 집게를 사용하여 오른쪽 L5 가로 돌기를 자릅니다. 그런 다음 마우스와 가열 패드를 사용자 정의 스테이지로 이동합니다. 스테이지를 사용하여 스테이지 테이프를 사용하여 동물과 가열 패드를 제자리에 고정합니다.

지속적인 이소플루란 마취를 위해 동물의 코를 코콘에 넣습니다. 자극을 쉽게 적용할 수 있도록 오른쪽 뒷발을 무대 밖 위치에 고정합니다. 척추뼈 또는 골반 뼈의 피부 위에 스테이지 클램프를 사용하여 척추를 제자리에 고정하고 L5 DRG의 주둥이와 꼬리쪽에 고정합니다. CL을 조정합니다.amps와 스테이지를 DRG의 표면을 가능한 한 수평으로 만듭니다.

그런 다음 대물렌즈가 낮아졌을 때 DRG 바로 위 8mm에 오도록 현미경 아래에 스테이지를 배치합니다. 직장 체온계를 삽입합니다. 직장 체온계의 가열 패드에 전력선을 연결합니다. 노즈 콘을 이소플루란 가스 라인에 연결합니다.

10x/0.4 DIC 대물렌즈와 이미징용 관련 소프트웨어가 있는 정립 공초점 현미경을 사용하십시오. 495나노미터에서 여기, 519나노미터에서 방출, 500에서 580나노미터 사이의 검출 파장의 녹색 FITC 필터 설정을 사용합니다. 현미경으로 DRG의 표면을 찾으십시오. DRG 표면이 가능한 한 수평이 되고 최대 표면적이 초점면에 시각화되도록 스테이지의 클램프를 조정합니다.

과다 복용 없이 이소플루란 마취를 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 동물을 모니터링하십시오. 현미경 고속 스캐닝 프로토콜을 로드하려면 복셀 크기 2.496 x 2.496 x 16 미크론, 512 x 512 픽셀, 10-광학 슬라이스 z-스택, 32마이크로미터용 1 Airy 장치, 488나노미터 및 5밀리와트의 1% 레이저 출력, 픽셀 시간 - 1.52 마이크로초, 라인 시간 - 0.91밀리초, 프레임 시간 - 465밀리초, LSM 스캔 속도 8, 양방향 스캐닝, PMD 감지기 이득 - 650V 및 디지털 이득 1.

획득 탭에서 실험 시작을 클릭하여 DRG의 짧은 8주기 스캔을 수행합니다. 시간이 지남에 따라 프레임당 한 번의 스캔에서 스캔을 직교로 투영하여 동영상을 만듭니다. 이미지 선명도 및 DRG를 가로지르는 밝기 파동과 같은 이미징 아티팩트를 수동으로 확인합니다. 클램프 위치와 광학 섹션 두께를 조정하고 선명한 고품질 동영상이 나올 때까지 이 단계를 반복합니다.

그런 다음 복셀 크기 1.248 x 1.248 x 14 미크론, 1024 x 1024 픽셀, 6개의 광학 슬라이스 z-스택, 1.2 Airy 단위 또는 39 마이크로미터, 488 나노미터 및 25 밀리와트의 5% 레이저 출력, 픽셀 시간 - 2.06 마이크로 초, 라인 시간 - 4.95 밀리초, 프레임 시간 5.06 초, LSM 스캔 속도 6, 양방향 스캐닝, 650V에서 PMT 검출기 이득 및 1의 디지털 이득.

획득 탭에서 실험 시작 버튼을 눌러 DRG의 고해상도 이미지를 만듭니다. 현미경 신속 스캐닝 프로토콜을 로드하고 DRG에서 80주기 동안 자발적인 활동을 기록합니다. 직교 프로젝션 동영상을 생성하고 이미지의 품질이 분석에 충분한지 확인합니다. 자극을 가하려면 현미경을 15-20회 스캔하도록 설정하십시오. 스캔 1에서 5가 완료될 때까지 기다렸다가 기준선을 생성합니다. 스캔 6에서 10 사이에 자극을 적용합니다. 탈감작을 방지하기 위해 다음 자극을 적용하기 전에 각 자극 후 최소 5분 정도 기다리십시오.

기계식 프레스의 경우 발을 건드리지 않고 패들 사이에 발로 알고리즘계 핀처를 잡습니다. 스캔 5가 끝난 직후에 시작하여 스캔 10 직후에 멈춥니다. 알고리즘으로 가압력을 모니터링하고 원하는 힘을 10g초과하지 않는지 확인하십시오.

열 자극의 경우 물이 담긴 비커를 원하는 온도 바로 위로 가열하십시오. 물이 올바른 온도에 있으면 스캔 직후 5 연못을 물에 담그고 자극을 가합니다. 스캔 10 직후 비커를 당겨 빼냅니다.