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Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio

Full Text

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06:43 min

September 30, 2011

DOI: 10.3791/3165-v

Corinna Singleman¹, Nathalia G. Holtzman¹

¹Department of Biology,Queens College, City University of New York

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

여러 발달 단계에있는 zebrafish 심장의 해부 및 격리에 대한 명확하고 표준화된 방법 설명되어 있습니다. 주석과 부량 기법도 설명합니다.

Transcript

이 절차의 전반적인 목표는 얼룩말 물고기의 심장을 제거하는 것입니다. 이것은 먼저 얼룩말 물고기를 수집하고 고정함으로써 수행됩니다. 다음으로, 체강을 열어 심장을 시각화합니다.

그런 다음 심장을 제거하고 심장이 아닌 조직을 청소합니다. 마지막으로 심장 사진을 찍습니다. 궁극적으로 시간이 지남에 따라 심장의 형태는 현미경, 절편 및 사진을 통해 볼 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 해부의 열쇠로 중요합니다. Sta는 제브라피쉬가 작고 조직의 색이 뚜렷하지 않고 식별하기 어려울 수 있기 때문에 배우기 어렵습니다. 유충에서 성체 단계까지 얼룩말 물고기를 생성합니다. 이러한 실험을 위해 성인 물고기와 개별 배 또는 그룹 짝짓기를 수행합니다.

배아를 세척하고 섭씨 28도의 인큐베이터에 보관합니다. 수정 후 5일이 지나면 물고기를 10-15 물고기 밀도의 수조로 분리하여 물고기 시설에 넣습니다. 적절한 나이에 수조에서 물고기를 꺼내 0.2% 트리카에 넣어 마취합니다.

마취된 물고기를 얼음물에 15분 동안 넣어 안락사시킵니다. 한편, XPBS 1개에 4%파라 포름알데히드 또는 PFA를 접시에 추가합니다. 수집된 물고기를 4% PFA에 담아 실온에서 1-2시간 동안 배양한 다음 퍼필로 감싼 페트리 접시에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

이렇게 하면 물고기가 평평하게 유지되고 고정 후 훨씬 쉽게 해부할 수 있습니다. 0.1%트윈으로 PBS에서 두 번 헹구거나 PBT 물고기는 섭씨 4도의 PBT에서 최대 10일 동안 보관할 수 있습니다. 신선한 PBS를 반쯤 채운 페트리 접시에 생선 한 마리를 넣고 오른쪽에 놓습니다.

디지털 밀리미터 캘리퍼를 사용하여 꼬리 지느러미를 포함하지 않고 주둥이에서 꼬리 바닥까지의 물고기의 길이를 측정합니다. 이것은 표준 길이 또는 sl입니다. 각 물고기에 숫자 문자 조합을 할당하여 개별 물고기와 그 결과로 해부된 심장을 추적하여 나중에 분석할 수 있도록 합니다.

모든 측정값을 포함한 모든 데이터를 스프레드시트에 입력하고 해부하기 전에 이러한 레이블을 기반으로 구성합니다. PCR 튜브 스트립에 추적 번호가 할당된 라벨을 부착하고 튜브를 PVT 또는 추가 분석에 적합한 기타 솔루션으로 채웁니다. 표준 길이가 12mm 미만인 물고기의 경우 집게로 몸을 안정시키고 눈을 잡고 아가미 사이에 머리를 고정하면서 페트리 접시에서 물고기 복부 위치를 위로 향하게 합니다.

핀 홀더에 날카로운 집게 또는 마이크로 바늘을 사용합니다. 몸에서 가슴 근육과 지느러미를 제거하여 심장을 드러냅니다. 해부 중 집게의 지속적인 움직임으로 인해 PPT에 물고기를 움직이는 전류가 발생할 수 있습니다.

이것은 특히 작은 물고기에게 문제가 됩니다. 따라서 마이크로니들을 사용하여 가슴 근육과 지느러미를 제거하고 체강을 열어야 합니다. 겸자를 사용하여 심방 아래에 있는 구멍에서 심장을 부드럽게 퍼냅니다.

물고기에 형광 심장 마커가 포함되어 있는 경우 형광 내시경을 사용하여 박리하고 형광으로 심장이 제거되었는지 확인합니다. 심장이 강에서 제거되면 집게를 사용하여 심장을 잡고 마이크로니들을 사용하여 심장 바깥쪽의 여분의 비심장 조직과 심외막을 제거합니다. 표준 길이가 12mm보다 긴 물고기의 경우.

스프링 손잡이가 있는 마이크로 가위를 사용하여 세 번 절개합니다. 먼저 아가미를 가로로 자릅니다. 둘째, 앞쪽 배를 또 한 번 가로 절개합니다.

셋째, 두 횡 절단을 연결하는 복부 쪽에 시상 절단을 만듭니다. 날카로운 집게를 사용하여 몸에서 가슴 근육과 지느러미를 제거하여 체강을 열고 심낭의 은빛 조직을 드러냅니다. 이 심낭 조직을 제거하면 심장이 보이게 됩니다.

마이크로 가위를 사용하여 심장 위쪽에 위치한 동맥구근에 연결된 동맥을 절단합니다. 이 동맥이 절단되면 겸자 끝을 심방 아래에 놓고 집게를 사용하여 심장을 구멍에서 퍼냅니다. 심장과 함께 제공되는 여분의 조직이 있으면 나중에 제거할 수 있으므로 괜찮습니다.

또는 일부 물고기의 경우 구근을 부드럽게 당겨 심장을 제거할 수 있으며 나머지 심장도 따라갈 것입니다. 아트리움은 쉽게 손상될 수 있으므로 대체 기술을 사용하는 경우 심방의 위치에 주의하십시오. 심장과 함께 제공되는 여분의 조직이 있으면 괜찮으며 나중에 제거할 수 있습니다.

심장이 강에서 제거되면 두 개의 집게를 사용하여 심장을 잡고 여분의 조직을 제거하거나 심장을 잡기 위한 집게 한 쌍과 마이크로니들을 사용하여 여분의 비심장 조직을 제거합니다. 제브라피쉬 심장을 촬영하려면 리터당 23g의 영양 한천 페트리 접시를 준비하고 응고된 한천을 PBS로 덮습니다. 집게를 사용하여 심장이 올바른 방향에 맞을 수 있도록 한천에 우물을 만듭니다.

구근의 끝을 잡고 PCR 튜브에서 심장을 제거합니다. 겸자로 단단히 고정. 한천 접시에 심장을 넣으십시오.

사진을 찍기 위해 한천의 심장 방향을 잡습니다. 샘플은 각 그림 뒤에 있는 모든 가능한 방향으로 회전할 수 있습니다. 머리 위, 빛, 짧은 노출 시간을 사용하여 하트 사진을 촬영합니다.

최상의 사진을 얻기 위해 필요에 따라 노출을 사용하여 광질을 조정합니다. 잘 절개된 깨끗한 심장의 예가 여기에 나와 있습니다. 각 심장은 전반적인 형태에 약간의 차이가 있지만 심장은 발달 후 온전한 심실 심방과 구근 동맥을 포함하는 완전해야 합니다.

이 기술은 제브라피시 심장 발달 분야의 연구자들이 제브라피시 발달의 다양한 단계에서 심장 성숙을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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