Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

이 비디오는 만성 간 손상 후 CD 1 33 세포 표면 발현을 사용하여 클론 확장을 연구하기 위해 간 줄기 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 먼저, 만성 간 손상을 입은 쥐에서 간을 제거하고 소화시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그런 다음 적혈구 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 제거하고 용액을 자기 CD 45 항체 함유 컬럼에 적용하여 CD 45 백혈구를 제거합니다.

그런 다음 CD 45 고갈된 세포를 분류하여 CD 1 33 양성 간 줄기 세포를 농축합니다. 마지막으로 CD 1 33 양성 간 줄기 세포를 분리하여 배양하고 증식시킵니다. 시험관 내 유전자 및 단백질 발현 분석은 분리된 CD 1 33 양성 줄기세포가 간세포와 골세포로 분화할 수 있음을 보여줍니다.

면역조직화학 기법을 사용한 마커의 공동 국소화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 클론 확장 및 기능 분석을 위해 단일 세포를 분리할 수 있다는 것입니다.줄기 및 프로 발전기 세포 표현형을 확인하기 위해 이 기술을 시연하는 것은 저와 그가 될 것입니다. 제 연구실의 대학원생입니다. 24시간 전에 매체에 있는 모든 완충액을 준비하고 모든 해결책을 다 사용할 때까지 4°C에서 저장하십시오.

매체, 기기, 필터 및 튜브는 멸균되어야 하며 멸균 기술로 취급되어야 합니다. 오염 위험을 줄이려면 안락사된 쥐의 복부를 70% 에탄올로 닦으십시오. 멸균 기구를 사용하여 복강을 열고 블록에 있는 간을 설명합니다.

이식된 간에서 담낭을 제거한 다음 전체 간을 층류 후드의 밀폐된 멸균 접시에 담아 층류 후드로 옮기고 멸균 면도날을 사용하여 여러 수평 및 수직 절단의 조합으로 간을 다집니다. 1분 동안 다진 간을 4부분으로 나누고 각 부분을 10ml의 효소 분해 용액이 담긴 15ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 45분 동안 넣고 초당 1-2주기로 설정된 셰이커에 넣습니다.

배양 후 70% 에탄올로 튜브를 닦습니다. 그런 다음 층류 후드 아래에서 70 미크론 메쉬 필터를 통해 소화 된 간 펄프를 피펫하고 멸균 접시에 흐름을 수집하여 더 큰 간세포를 포함하는 실질 분획을 제거합니다. 2ml의 멸균 보충제 D-M-E-M-F 12 배지로 필터를 헹굽니다.

주사기 플런저의 고무 끝을 사용하여 소화된 펄프를 필터를 통해 으깨십시오. 이 과정을 5회 반복하여 총 부피가 약 20밀리리터가 되도록 합니다. 여과액을 2개의 동등한 15 밀리리터 관으로 나누고, 그 후에 50배 G에 4 °C에 1분 동안 원심분리기를 하십시오.

스핀을 따라가다. SUP natin을 snat number one이라고 표시된 튜브로 옮기고 실질 palt를 버립니다. 다음으로 줄기세포와 전구세포를 포함하는 비실질 분획을 채취하기 위해 원심분리기 SUP natin 1호를 1분 동안 G를 50회 첨가합니다.

상층액을 상층액이라고 표시된 튜브로 옮깁니다. 두 번째, 그리고 다시 펠릿을 버리십시오. 그런 다음 원심 분리기 supernat number 2를 1 분 동안 50 번 G로 누릅니다.

스핀을 따라 상등액을 상등액 번호 3이라고 표시된 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 마지막으로, 스핀 후 비실질 분획을 얻기 위해 8분 동안 180배 G 동안 최종 SNAT 번호 3을 원심분리하고 상층액을 버리고 적혈구와 펠릿이 묶인 프로토콜의 다음 단계로 즉시 진행합니다. 절차의 이 부분에 사용된 적혈구 용해, 완충액 및 밀 테네 완충액은 전날 밤에 준비되어야 하며 동봉된 서면 문서의 지침에 따라 섭씨 4도에서 보관되어야 합니다.

얼음 위의 세포와 용액을 사용하여 층류 후드에서 작업합니다. Resus는 위의 단계에서 비실질 펠릿을 1 x 희석된 적혈구 용해 완충액 1ml에 현탁시키고 5ml 튜브로 옮깁니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 5초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다.

섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 15분이 지나면 빛으로부터 보호됩니다. 스핀 후 5분 동안 200배 G로 튜브를 원심분리하여 용해된 적혈구와 소생이 포함된 상층액에 흉터

펠릿을 차갑고 멸균 된 1 밀리리터의 얼음에 현탁시킵니다. 200배 G의 e 완충기 원심분리기를 5분 동안 녹입니다. 스핀 후, 상등액을 버리고 펠릿을 1 밀리리터의 얼음처럼 차갑고 멸균 된 상태로 다시 현탁시킵니다.

Milton e buffer. 그런 다음 이 세포 현탁액 10마이크로리터를 제거하고 10마이크로리터 스트라이프 am blue를 추가합니다. 비실질 분획에서 CD 45 조혈 세포 고갈을 수행하기 위해 혈구 분석기를 사용하여 비실질 세포를 계수합니다.

층류 후드에서 세포의 농도를 10에서 7번째로, 10에서 8번째까지 조정하여 시작합니다. 100마이크로리터의 용융된 완충액에 있는 총 세포. 전체 절차 동안 세포와 버퍼를 차갑게 유지하십시오.

다음으로, 세포 1,000만 개당 20마이크로리터의 mil, CD 45 마이크로비드 항체를 적용하고 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 2 밀리리터 mil, 완충액 및 원심 분리기를 추가로 5 분 동안 200 배 G로 첨가합니다. 스핀 후 스내팅을 제거하고 10ml에서 8번째 세포까지 재현탁합니다.

Milt, 층류 후드의 모든 버퍼는 Milt, LD 자기 기둥을 자기 홀더에 놓습니다. 여과액을 걸러내기 위해 필터 아래에 멸균 5ml 튜브를 놓습니다. 그런 다음 2밀리리터를 로드합니다.

버퍼를 녹여 필터 사전 세척을 수행합니다. 세척이 완료되면 셀을 컬럼에 로드합니다. 세포 현탁액이 컬럼 내에 있으면 1밀리리터의 용융 e 버퍼를 추가하여 컬럼을 세척하고 이 세척을 두 번 더 수행합니다.

여과 속도를 높이기 위해 컬럼과 함께 제공된 플런저를 사용하지 마십시오. 모든 세척이 수행되면 수집된 CD 45 고갈된 비실질 세포의 여과액을 200배 G에서 5분 동안 원심분리합니다. cd 45개의 양성 세포가 유지된 컬럼을 폐기합니다.

다음으로 유세포 분석은 CD 1 33 양성 세포를 분리하고, Milt의 세포를 재현탁시키고, 임의의 완충액, 100 마이크로 리터 당 7 개의 세포를 100 마이크로 리터 분취 100 마이크로 리터를 첫 번째 튜브에 3 개의 튜브로 나누기 위해 수행됩니다. 두 번째 튜브에 2마이크로리터의 CD 1 33 PE 접합 항체를 추가합니다. IgG PE 접합 항체를 대조군으로 추가합니다.

세포의 세 번째 튜브는 염색되지 않은 대조군으로 사용되며, 배양 후 암흑 속에서 15분 동안 섭씨 4도에서 배양한 후 2밀리리터의 염색 완충액 원심분리기에서 5분 동안 200배 G로 재부유합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 1 밀리리터 Milton e buffer에 재현탁시킵니다. 다음으로, 유세포분석기에서는 염색되지 않은 세포와 IGPE 염색 세포를 사용하여 CD 1 33 양성 세포 집단의 게이팅을 최적화하기 위한 분류 매개변수를 조정합니다.

당사의 FICO ERYN 또는 RPE는 일반적으로 488나노미터를 방출하는 레이저가 있는 모든 유세포 분석기와 함께 사용할 수 있습니다. 마지막으로, CD 1 33 양성 보행을 사용하여 CD 1 33 양성 세포 집단을 분리하고 멸균 여과된 타원형 세포 배지에 세포를 수집합니다. 이제 세포를 배양할 수 있으며 클론 분리를 수행한 후 Real-Time PCR을 수행하여 잠재적 상태별로 평가할 수 있습니다 CD 1, 33.

양성 간 줄기 세포는 여기에서 볼 수 있듯이 이 비디오에 설명된 대로 야생형 및 MAT 1 A 녹아웃 마우스에서 분리되었습니다. CD 1 33 양성 세포는 만성 간 손상의 모델인 유전자 녹아웃 MAT 1 A 마이너스 마이너스에서 야생형 마우스의 손상되지 않은 간에서 파생된 고농축 CD 45 고갈 비실질 대조 분획의 0.4%를 구성합니다. CD 1 33 양성 모집단은 동일한 고도로 농축된 분수에서 10배 이상 확장됩니다.

그 후, 분류하는 세포를 배양하고 클론을 증식시켰다. 표시. 다음은 라미닌으로 코팅된 96개의 웰 플레이트에서 확장된 단일 CD 1 33개의 양성 세포에서 파생된 4개의 콜로니의 위상차 이미지입니다. 이 세포는 분리 후 7일이 지났으며 집락이 약 25개의 세포일 때 7일째에 작고 조밀한 상피 세포 집락을 보여줍니다.

세포로부터 RNA를 분리하고, 담관 부위 마커 CK 19의 유전자 발현을 분석하였는데, 이는 이들 R-T-P-C-R 실험에서 알 수 있는 바와 같다. 유전자 발현은 간세포 마커 알부민 및 담관 부위 마커 CK 19의 발현을 입증하며, CD 1 33 양성 초기 단세포 분리 및 체외 증식 후 몇 주 후에 CD 1 33 양성 세포의 잠재적 상태에 의해 확인되며, 시험관 내에서 10 배 10 매트 하나에서 6 개의 세포로, 마이너스 마이너스 모델을 면역 결핍 누드 마우스에 피하 주입한다. 화살표는 세포가 주입된 후 4주 후에 종양이 자라는 것을 나타냅니다.

CD 1 CCL 4 또는 0.1% DDC 다이어트와 같은 독소로 인한 만성 간 손상으로 인한 33개의 양성 세포는 종양을 형성하지 않습니다. Tumor formation of vivo는 줄기세포 집단 내에서 악성 잠재력 또는 암 줄기세포 표현형을 확인하는 데 사용됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 8시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 EPAM 또는 기타 사실과 같은 추가 사실 마커를 추가합니다. 간 전구 세포 집단의 표면 마커를 정제하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 side population flx와 같은 기술을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유세포 분석을 사용하여 간 줄기 세포와 전구 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

동물 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용 및 적절한 실험실 기술과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.