Name: Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 CD133+ 간 줄기세포 분리법으로 유전자 발현 분석과 단일세포 클론 확장을 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 간 재생 및 암 연구에 필수적인 도구입니다.

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박사 Rountree 아이의 기적 네트워크, 건강의 국립 연구소, K08DK080928 및 R03DK088013, 그리고 미국 암 협회의 연구 학술 상, MGO - 11651에서 현재의 지원을 인정한다. 박사 Rountree는 소아 과학 개발 프로그램 (NICHD 부여 수상 K12 - HD00850)에 의해 재정 지원을하면서이 프로 시저가 처음 개발하고 세련된 것을 인정합니다.

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+%28TGF%29-beta-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
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<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
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</ol>

박사 Rountree은 바이엘의 조제학의 연구 지원을받습니다. Drs. 땡와 사기꾼과 부인 저런와 양 VanKirk는보고도 공개가 없습니다.

조혈 시스템과는 달리,있는 조혈 줄기 세포가 replacesnormal physiologic 설정 - 이상 leukocytes, 적혈구 및 혈소판, 간 줄기 세포, 또는 성인 간 전구 세포의 정상 간에 참여하지 않는 세포 차별화 시스템을 유지하는 책임이 있습니다 항상성은. 급성 간 손상 또는 일부 hepatectomy, hepatocytes, 후 5,6는 차별화된 간 상피로, 잃어버린 간 질량을 대체하는 확산 여러 순찰을 받고있다. 5,6만을 만성 부상 중에하는 것이 관찰 간 줄기 세포 아르 분아 따위에 의해 번식합니다. 1.5은 -11 이러한 성인, 장기 특정 줄기 세포는 1,5-8은 흥미롭게도, 간암의 대부분이 만성 부상의 배경에 개발하고 있습니다. hepatocytes과 cholangiocytes 모두에 차별화하는 제안이며, 따라서 간 줄기 세포도 될 가상 아르 간암의 하위 집합에 대한 엽 성의 전구 물질. 2-4,12-17 간장의 세포 활동을 막기위한 주요 과제 중 하나는 기능 분석을위한 세포의 희귀 인구의 격리입니다. 예를 들어, 간장의 세포의 대부분은 cholangiocytes 및 기타 작은 비 parenchymal 세포보다 훨씬 큰 hepatocytes입니다. 세포 구획 (- parenchymal 분수와 작은 세포 - 대형 hepatocytes 비 parenchymal 분율)으로 전체 간을 파괴함으로써, 더 나아가 CD45 음성 세포 (비 조혈 세포)에 대한 선택, 우리는에 의해 줄기 세포의 시작 인구를 풍성하게하실 수 있습니다 600 배. 통해, 우리는 CD133 +의 인구가 100 % 순수 줄기 세포 인구이지만, 분명히 다른 혈통과 repopulation 잠재력과 세포의 이종 인구를 대표하는 것을 나타내는 의미없이 노트 1,18-21 있습니다. 분야의 주요 한계 중 하나는 줄기 세포와 전구 세포의 정의입니다. 우리는이 작품에 더 널리 용어 &quot;줄기 세포&quot;를 사용하지만, 엄격한 정의에, CD133 + 비 parenchymal 세포는 이중 혈통 시조 인구를 나타냅니다. 간장에 현재의 줄기와 시조 연구의 상태 감안할 때,이 보고서는이 분야에 관심이있는 조사를위한 출발점을 제공한다. 새로운 마커 이러한 EpCAM, 22,23 또는 Sox9과 같은 전사 요소 24로, 등장으로 그들은 포함될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 EpCAM + 세포 및 CD133 + 세포 사이의 중복의 비교적 높은 비율을 발견했다. 이 보고서에서는, 우리는 세부 정상 murine 간뿐만 아니라 만성 간 손상 모델, 보여주 증가 간 줄기 세포 증식에​​서 줄기 세포 분리를위한 프로세스를. 라이브 세포를 사용하여 기능성 연구가 분리 후 수행할 수 있으므로이 방법은 냉동 또는 포르말린 고정 간 표준 immunohistochemistry를 통해 분명히 장점이 있습니다.이 과정 1,3,4 구체적인 목표는 수 간 줄기 세포의 비교적 순수한 인구를 분리하는 것입니다 clonally 체외로 확대됩니다. 이 절차에 대한 기본 제한은 고립된 세포의 대부분은 (문제 해결 섹션을 참조) 유동세포계측법 후 가능한되지 것입니다. 이것은 세포를 준비하는 데 필요한 시간의 결과이며, 사전에 격리하는 인구를 수정하는 데 필요한 다양한 절차. 간장은 즉각 FACS 분석을위한 단일 세포 현탁액에서 소화 경우, hepatocytes 및 기타 비 - parenchymal 세포 사이의 크기 차이가 효과 FACS 게이트 생성이 불가능하게됩니다. 간 이외의 parenchymal 세포는 조혈 세포의 제거없이 활용하는 경우, CD133 + 세포의 상당수가 소수를 오염시킬 수 있습니다 조혈 원산지 수있는 위험이 있습니다. 또한, Miltenyi 필터를 통해 세포를 처리하여, 단 하나의 세포와 세포의 아주 작은 클러스터는 회수됩니다. 이것은 예제에서는 FACS 흡기 바늘을 방해할되지 않습니다 보장합니다. 이 절차에 대한 대안은 CD49f, EpCAM 같은 다른 세포 표면 마커에 대한 수정, 또는 CD133 + EpCAM로 ​​마커의 조합을 포함 + 두 번째 출판 보고서가 아닌 parenchymal 분수에서 간 줄기 세포를 분리하기 위해 밀도 구배을 활용합니다. 이 절차는 울트라 원심 (8,000 XG)가 필요합니다, 절차에 상당한 시간을 추가하고, 우리의 경험에 크게 사전 FACS 세포 수율 및 사후 FACS 생존을 감소. 8 이후의 실험은 같은 HNF3, HNF4α 및 αfp.In 추가로 태아 간 유전자를 포함한 유전자 발현 분석의 광범위한 범위를 포함, 표현 단백질의 서양 얼룩 분석 및 immunocytochemistry는 문화에 세포의 RT - PCR 결과를 확인하기 위해 이용하실 수 있습니다. 참고 한 문제는 우리는 이제 정기적으로 (문제 해결 섹션을 참조) 별 모양의 세포 마커에 대한 우리의 샘플을 화면 25. 간성 별 모양의 세포에서 CD133 표현을 식별 최근 작업이고, ID가 없습니다우리 분수에 상당한 오염 entified. 이것은 간 소화하고 세포 분리의 다른 기술과 관련이있을 수 있습니다. 2,3,26은 세포의 대부분은 즉시 FACS 절연 후 가능한되지 않습니다 사실을 바탕으로, 우리는 동물에서 사용하기 전에, 대량 CD133 + 세포 단일 세포와 같은 하나의 세포가 도금하는 것이 좋습니다. 체외에서 5~7일 크게 종양의 분석 결과를 향상됩니다. 식민지가 대량 CD133 + 세포를 고립에서 확장 가능한 한 또한, 단일 세포 분리의 엄격 주어진이에만 실시해야합니다. 문화 간 줄기 및 전구 세포로 활용 될 수있는 다양한 문화 조건 및 비계 단백질의보다 철저한 논의가 잘 롤라 리드에 의해 특징되었습니다. 이 작품은 기본 절연 기술이 마스터되면 수사관들이 연구 프로그램에 통합할 수 있습니다 대안 조건 및 수정을 제공합니다. 27,28 박사는 리드의 작품 또한 혈통 생물학과 간장의 줄기 세포와 헌신 progenitors 사이에 성숙의 상세한 분석을 제공합니다. 생체내 종양의 분석 측면에서, 우리는 주로 1x10 6 세포를 사용하여 체외에서 clonally 확장 CD133 + 세포에서 갓 격리 세포와 세포를 사용하여 성공을 있었다. / - - 그리고 간 특정 Pten - / - 우리는 만성 간 손상의 ontwo 유전자 변종, MAT1a 초점이 마우스를, 우리는 누드 마우스 및 종양 성장을위한 숙주로 야생 형 생쥐를 모두 활용합니다. 그들이 사전 악성 아르 큰 간 손상 모델에서 격리하는 경우 우리의 경험에서 CD133 + 간 줄기 세포는 종양을 형성합니다. 참고 CD133에서 형성 종양 + 일반 종양에 대한 줄기 세포 또는 전구 세포의 기원을 제안, 간세포암 및 cholangiocarcinoma 기능을 모두 가지고 세포. 2-4,29 종양이 문서화 후 후속 작업은 종양 조직 (H &amp; E의 얼룩) 및 immunohistochemical 얼룩의 표준 pathologic 분석을 포함하고 있습니다. 또한, 종양은 FACS 분석하거나 다시 문화 다진 및 소화 수 있습니다. 2-4,30 결론적으로, 우리는 고립, 확장, 및 CD133 + 간 줄기 세포 및 CD133 + 암 줄기 세포의 기본 특성에 대한 절차를 자세히 있습니다. 문제 해결 : CD45 오염 : 3 단계에 대한 사전 FACS 분석 및 격리에 대한 CD45 - FITC AB를 추가하여 평가 수 있습니다 CD45 + 세포의 오염이있다면, CD45 microbead 항체가 만료되지 않도록 확인하고 여과액에만 동안 수집했다는 필터는 자석 홀더에. 필터가 자석 홀더가 CD45 + 세포를 포함하지 않을 동안 모든 여과물가 수집. 저가 휴대폰 번호 : 손상되지 않은 간, CD133의 총 숫자는 + 비 parenchymal 격리는 10,000보다 수 있습니다. 이러한 세포는 정지 간장에 드문 있습니다. 등 DDC 0.1 %의 음식으로 만성 부상 모델의 경우 숫자는 100,000 세포에 크게 증가합니다. 전체 휴대폰 번호가 크게 숫자보다 낮으면, 고려 하나의 문제는 FACS AB의 염색법이다. 가난한 얼룩이 가난한 항복의 결과 있으므로 CD133 AB는, 유효 기간이 만료되지 않도록 확인하십시오. 또한, 우리는 이전에 시도 FACS 절연에 상대적으로 인구를 결정하기 위해 간 비 parenchymal 세포 FACS 분석을 수행하는 것이 좋습니다. FACS 후 낮은 세포 생존 능력 : 생존의 문제 중 하나는 세포가 처리 그리고 시간이 지남에 따라하는 방법과 관련이있을 수 있습니다. 이상적으로, 전체 세포 격리 절차, 1-4 단계는 단계 사이에 지체없이 실시하고 같은 하루에 완료되어야합니다. 1-4 단계 사이에 상당한 지연이 크게 세포 생존을 줄일 수 있습니다. 세포 생존에 관한 두 번째 문제는 FACS 절연에 사용되는 외장 압력과 관련이있을 수 있습니다. 우리는 낮은 칼집 압력을 사용하는 것이 좋습니다. 정렬 후 얼음에 대한 상당한 저장 용량 또한 생존을 감소되므로 마지막으로, 세포가 고립되면, 그들은 즉시 도금한다. CD133 + 비 parenchymal 이질 : 최근 보고서는 간장 별 모양의 세포도 CD133 표현을 일부 소성을 할 수 있습니다 나타냅니다. 따라서 25, 알부민 및 Krt19와 BI - 힘의 유전자를 확인 이외에, 추가 검증 그런에 glial fibrillary 산성 단백질로 별 모양의 세포와 관련된 유전자를 포함시킬 수 있습니다 정지 별 모양의 세포와 활성 별 모양의 세포에있는 알파 평활근의 굴지 및 desmin가. 3,4,26은 또한, CD133 + 인구는 광범위한 시조 인구를 나타냅니다. 같은 EpCAM로 ​​두 번째 마커,의 또한 더욱 인구를 수정하는 데 도움이, 그리고 제한 이질 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> DMEM : F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> 페놀 레드 </td></tr><tr><td> CD45 microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Hepatocyte 성장 인자 </td><td> 시그마 </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 </td><td> 시그마 </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> 시그마 </td><td> DN25 </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> 호슈 </td><td> 1,088,874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 호슈 </td><td> 0,165,921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 미크론 메쉬 스트레이너 </td><td> 어부 </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 반응 </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD 칼럼 </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 - PE FACS AB </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin 코팅 접시 </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 잘 96 </td></tr><tr><td> 트립신 0.05 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> RNeasy 마이크로 키트 </td><td> Quaigen </td><td> 74,004 </td><td> 5x10 5 세포 이하 50 열 </td></tr><tr><td> 알약은 Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> 10X 농도 </td></tr></tbody></table>

clonal 확장 cd133 + 간 줄기 세포의 분리

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

간 줄기 세포, 또는 타원형 세포, 만성 간 손상시 세포 분열 따위에 의해 번식하고, hepatocytes 및 cholangiocytes 모두에 차별화하는 제안입니다. 또한, 간 줄기 세포는 간암, 간세포암의 하위 집합에 대한 엽 성의 전구 물질로 가상하고 있습니다. 간 원하는 고체 장기의 세포 활동을 막기위한 기본 과제 중 하나는 자세한 분석을 위해 세포의 드문 인구의 격리입니다. 예를 들어, 간장의 세포의 대부분은 비 - parenchymal 세포보다 훨씬 큰 hepatocytes (parenchymal 소수)입니다. 간 (예 : parenchymal 및 비 - parenchymal 분수)의 특정 세포 구획을 풍요롭게하고, CD45 음성 세포에 대한 선택함으로써, 우리는을 위해 허용이 리포트에 proceduresdetailed 600 fold.The 이상에 의한 줄기 세포의 시작 인구를 풍성하게하실 수 있습니다 확실한 장기의 세포의 비교적 드문 인구는 효율적으로 정렬합니다. 이 프로세스는 증가 간 줄기 세포 증식을 보여주 정상 murine 간장에서 isolateliver 줄기 세포뿐만 아니라 만성 간 손상 모델에 활용할 수 있습니다. 라이브 세포를 사용하여 기능성 연구가 초기 공동 지역화 실험 이후에 수행할 수 있습니다대로이 방법은 냉동 또는 포르말린 고정 간 표준 immunohistochemistry를 통해 분명히 장점이 있습니다. FACS 절연의 세부 전문 계측 및 기본적인 흐름 cytometry 절차의 강력한 실무 지식에 크게 의존 본 보고서에 설명된 절차를 수행하려면 연구 기반 흐름 cytometry 코어와 함께 작동하는 관계는 강력하게 권장됩니다. 이 과정의 구체적인 목표는 clonally 체외에서 확장 가능한 간 줄기 세포의 인구를 분리하는 것입니다.

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

간 줄기세포 또는 오발 세포(oval cells)는 만성 간 손상 시 증식하며, 간세포와 담관세포 모두로 분화하는 것으로 제안되어 왔습니다. ...

이 영상에서는 만성 간 손상 후 CD 1 33 세포 표면 발현을 이용해 클론 확장을 연구하기 위한 간 줄기세포 분리 절차를 보여줍니다. 먼저, 만성 간 손상을 입은 마우스에서 간을 적출하고 이를 소화시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 그 다음 적혈구 용해 버퍼를 첨가하여 적혈구를 제거하고, 해당 용액을 CD 45 항체가 포함된 자성 컬럼에 통과시켜 CD 45 백혈구를 제거합니다.그 후 CD 45 결핍 세포를 분리하여 CD 1 33 양성 간 줄기세포를 농축합니다. 최종적으로 분리된 CD 1 33 양성 간 줄기세포를 배양하고 확장합니다. 인 비트로(in vitro) 유전자 및 단백질 발현 분석 결과, 분리된 CD 1 33 양성 줄기세포가 간세포와 골세포 모두로 분화할 수 있음이 입증되었습니다.면역조직화학 기법을 이용한 마커의 공국소화(colocalization)와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 세포를 분리하여 클론 확장 및 기능 분석을 수행할 수 있다는 점입니다. 줄기세포 및 전구세포의 표현형을 확인하기 위해, 본인과 저희 실험실의 대학원생인 he dang이 이 기술을 시연하겠습니다. 모든 완충액과 배지는 사용 24시간 전에 미리 준비하여 4°C에서 보관하십시오.배지, 기구, 필터 및 튜브는 멸균 상태여야 하며 멸균 기술을 사용하여 취급해야 합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 안락사시킨 마우스의 복부 부위를 70% ethanol로 닦아냅니다. 멸균된 기구를 사용하여 복강을 열고 간을 노출시킵니다.적출한 간에서 담낭을 제거한 후, 폐쇄형 멸균 접시에 담아 층류 후드로 옮깁니다. 멸균 면도날을 사용하여 간을 가로와 세로 방향으로 여러 번 반복해서 절개하여 잘게 다집니다. 다져진 간을 4등분하여 각각 10 mL의 효소 소화액이 들어 있는 15 mL 튜브에 넣고 1분 동안 진행합니다. 그런 다음, 튜브를 1~2 cycles per second로 설정된 쉐이커가 있는 37 °C 항온수조에 45분 동안 둡니다.배양 후 70% ethanol로 튜브를 닦아냅니다. 그 다음 층류 정화 후드(laminar flow hood) 아래에서, 소화된 간 조직 펄프를 70 micron 메쉬 필터에 피펫으로 통과시키고, 더 큰 간세포를 포함하는 실질 분획(parenchymal fraction)을 제거하기 위해 여과액을 멸균 디쉬에 수집합니다. 멸균된 보충제 함유 D-M-E-M-F 12 배지를 2 mL씩 나누어 필터를 헹굽니다.시린지 플런저의 고무 부분을 사용하여 소화된 펄프를 필터를 통해 으깹니다. 이 과정을 다섯 번 반복하여 총 부피를 약 20 milliliters로 만듭니다. 여과액을 두 개의 15 milliliter 튜브에 동일하게 나누어 담은 후, 4 °C에서 50 ×g로 1분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 'snat 1'이라고 표시된 튜브로 옮기고 실질 펠렛은 버립니다. 다음으로 줄기세포와 전구세포가 포함된 비실질 분획을 수집하기 위해, 상층액 1번을 50 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.상층액을 'supernatant number two'라고 표시된 튜브로 옮깁니다. 다시 한번 펠렛을 제거합니다. 그런 다음 supernatant number two를 50 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 '상층액 3번'이라고 표시된 튜브로 옮기고 펠릿은 제거합니다. 마지막으로, 비실질 분획을 얻기 위해 최종 SNAT 3번을 180 ×g에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 적혈구와 펠릿이 처리되는 프로토콜의 다음 단계로 즉시 진행합니다. 이 절차에 사용되는 적혈구 용해 버퍼와 밀테네 버퍼는 동봉된 서면 문서의 지침에 따라 전날 밤에 준비하여 4 °C에서 보관했어야 합니다.세포와 용액을 얼음 위에 둔 상태로 라미나 플로우 후드(laminar flow hood) 내에서 작업합니다. 위 단계에서 얻은 비실질 세포 펠릿(non parenchymal pellet)을 1 mL의 1x 희석 적혈구 용혈 버퍼(red blood cell lysis buffer)에 재현탁하여 5 mL 튜브로 옮깁니다. 튜브 뚜껑을 닫고 5초 동안 부드럽게 볼텍싱(vortex)합니다.4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 15분이 지난 후 빛으로부터 차단하여 보호합니다. 튜브를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 용해된 적혈구가 포함된 상층액을 제거하고 재현탁합니다.펠렛을 얼음처럼 차갑고 멸균된 buffer 1 mL에 현탁합니다. 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 펠렛을 얼음처럼 차갑고 멸균된 용액 1 mL에 다시 현탁합니다.Milton e 완충액을 사용합니다. 그다음 이 세포 현탁액에서 10 µL를 취해 10 µL의 stripe am blue를 첨가합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 비실질 세포 수를 측정함으로써, 비실질 분획으로부터 CD 45 조혈 세포 제거를 수행합니다.층류 정화 작업대(laminar flow hood)에서 melty buffer 100 µL당 세포 총 수를 10⁷~10⁸개로 농도를 조절하며 시작합니다. 전체 과정 동안 세포와 버퍼를 계속해서 차갑게 유지하십시오.다음으로, 세포 1,000만 개당 20 µL의 mil, any CD 45 microbead antibody를 처리하고 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, mil, any buffer 2 mL를 추가로 넣고 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 10⁸개의 세포를 1 mL에 재현탁합니다.층류 후드 내의 임의의 완충액을 사용하여, 마그네틱 홀더에 임의의 LD 마그네틱 컬럼을 장착합니다. 여과액을 수집하기 위해 필터 아래에 멸균된 5 mL 튜브를 배치합니다. 그다음 2 mL를 로딩합니다.필터 사전 세척을 수행하기 위해 임의의 버퍼를 녹입니다. 세척이 완료되면 세포를 컬럼에 로딩합니다. 세포 현탁액이 컬럼 내에 들어가면, 컬럼을 세척하기 위해 1 mL의 melt e 버퍼를 추가하고, 이 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.여과 속도를 높이기 위해 컬럼에 제공된 플런저를 사용하지 마십시오. 모든 세척 과정이 완료되면, 수집된 CD 45 결핍 비실질 세포 여과액을 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하십시오. CD 45 양성 세포가 남아 있는 컬럼은 폐기하십시오.다음으로 CD133 양성 세포를 분리하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 세포를 Milt any buffer에 재현탁하여 100 µL당 10⁷개의 세포가 되도록 한 후, 100 µL씩 세 개의 튜브에 분주합니다. 첫 번째 튜브에는 아무것도 넣지 않습니다. 두 번째 튜브에는 CD133 PE 접합 항체 2 µL를 첨가합니다. 세 번째 튜브에는 대조군으로 IgG PE 접합 항체를 첨가합니다.세 번째 세포 튜브는 비염색 대조군으로 사용하며, 암소에서 4°C로 15분간 배양합니다. 배양 후 2 mL의 염색 완충액으로 재현탁하고 200 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 1 mL의 Milton e 완충액에 재현탁합니다. 그다음 유세포 분석기에서 비염색 세포와 IGPE 염색 세포를 사용하여 CD 1 33 양성 세포 집단의 최적화된 게이팅을 위한 소팅 파라미터를 조정합니다.본 연구의 FICO ERYN 또는 RPE는 일반적으로 488 nm의 파장을 방출하는 레이저가 장착된 모든 유세포 분석기에서 사용할 수 있습니다. 마지막으로, CD133 양성 게이트(gait)를 사용하여 CD133 양성 세포 집단을 분리하고, 멸균 여과된 oval cell 배지에 세포를 수집합니다. 이제 분리된 세포를 배양하고 클론 분리를 수행할 수 있으며, 이후 실시간 PCR을 통해 CD133의 잠재적 상태를 평가할 수 있습니다.여기에서 보는 바와 같이, 이 비디오에서 설명한 대로 야생형 및 MAT1A 녹아웃 마우스로부터 양성 간 줄기세포를 분리하였습니다. 야생형 마우스의 손상되지 않은 간에서 유래한 고농축 CD45 결핍 비실질 대조군 분획에서 CD133 양성 세포는 0.4%를 차지하며, 만성 간 손상 모델인 유전자 녹아웃 MAT1A -/- 에서는 동일한 고농축 분획 내 CD133 양성 세포군이 10배 이상 확장됩니다.분리 후 세포를 배양하고 클론을 확장하였습니다. 여기에는 라미닌 코팅된 96-웰 플레이트에서 확장된 단일 CD 1 33 양성 세포 유래 4개 콜로니의 위상차 이미지들이 나와 있습니다. 이 세포들은 분리 후 7일이 경과한 상태이며, 콜로니당 약 25개의 세포로 구성된 작고 조밀한 상피세포 콜로니를 보여줍니다.세포에서 RNA를 분리하였으며, 이 R-T-P-C-R 실험에서 볼 수 있듯이 담관 부위 표지자인 CK 19의 유전자 발현을 분석하였습니다. 유전자 발현 결과, 간세포 표지자인 albumin과 담관 부위 표지자인 CK 19의 발현이 확인되었으며, 이는 CD 1 33 양성 단일 세포를 처음 분리하여 체외에서 증식시킨 지 수주 후 CD 1 33 양성 세포의 잠재적 상태를 통해 확인되었습니다. mat one, A-- 모델로부터 얻은 1×10⁶ 개의 세포를 면역 결핍 누드 마우스에 피하 주입하였습니다. 화살표는 세포 주입 4주 후 성장한 종양을 나타냅니다.CCL4 또는 0.1% DDC 식이와 같이 독소로 유도된 만성 간 손상에서 유래한 CD133 양성 세포는 종양을 형성하지 않습니다. 생체 내(in vivo) 종양 형성은 줄기세포 집단 내에서 악성 잠재력 또는 암 줄기세포 표현형을 확인하는 데 사용됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차 이후에 EPAM 또는 다른 표지자와 같은 추가적인 표면 마커를 추가할 수 있습니다. 간 전구세포 집단의 표면 마커를 정교화하는 것과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 side population 분석과 같은 기술을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 유세포 분석법을 사용하여 간 줄기세포 및 전구세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.동물 조직을 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용 및 적절한 실험실 기술과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

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