December 28th, 2011
단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.
이 프레젠테이션의 목표는 먼저 생존 가능한 성인 마우스 심근세포의 분리를 설명한 다음 두 가지 단일 세포 유전자 발현 분석 방법을 시연하는 것입니다. 쥐에서 심장을 해부한 후 심장에 콜라겐분해효소 분해 용액을 관류하여 단일 세포를 얻습니다. 단일 세포의 정량적 PCR을 위해 정제된 세포는 QPCR 분석을 직접 받습니다.
분리된 심근세포는 마이크로어레이 분석에도 사용할 수 있습니다. 단일 세포의 마이크로어레이 분석에는 mRNA 추출, 플렉스 라이브러리를 통한 전체 전사체 증폭, 제한적 증폭, 마지막으로 마이크로 어레이 칩에 대한 라벨링 및 혼성화가 포함됩니다. 두 절차의 마지막 단계는 고품질 데이터를 보장하는 것입니다.
이러한 절차는 개별적으로 분리된 성인 심근세포에서 강력한 유전자 발현 분석이 가능하다는 것을 보여줍니다. 전체 조직 균질산염의 유전자 발현 프로파일링과 같은 기존 방법에 비해 이 방법의 장점은 단일 세포 내 유전자 발현에 대한 정보와 세포 간 발현의 가변성에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 필요한 용액 및 완충액, 말기 진정제, 0.25ml의 IP 주입이 있는 마우스, 펜토바르비탈 나트륨 용액을 포함한 준비된 분리 시스템으로 시작하여 마우스가 의식을 잃고 통증 자극에 반응하지 않는지 확인합니다.
마우스가 멈추기 전에 마우스를 안락사시키기 위해 이산화탄소나 경추 탈구를 사용하지 마십시오. 숨을 조심 하 게 잘라 냅니다. 횡격막을 통해 흉곽 가장자리를 따라 흉강을 엽니다.
그런 다음 위쪽으로 우월하게 자르고 앞쪽 흉곽을 반사합니다. 미리 자른 플라스틱 피펫에 심장을 부드럽게 빨아들이고 흉부에서 심장을 절제합니다. 심장을 얼음처럼 차가운 소화 속으로 떨어뜨립니다.
완충 A를 하고 15초에서 45초 후에 혈액을 헹구고, 두 번째 간단한 헹굼을 수행하고, 완충 A를 실시한 다음, 완충액 A를 사용하여 심장을 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 대동맥과 대동맥 가지를 조심스럽게 분리하십시오. 대동맥을 마지막 가지보다 약간 아래쪽으로 자릅니다.
캐뉼라 팁을 관상 동맥 위의 대동맥에 끼우고 4 개의 oh 또는 six oh 봉합사로 제자리에 결찰합니다. 소화 완충액 A를 사용하여 관류를 시작합니다.심장에서 혈액이 씻겨 나감에 따라 유출이 빨간색에서 투명색으로 바뀝니다. 동물을 자루에 넣고 심장을 풍성한 장비에 연결하는 데 걸리는 시간은 매우 중요합니다.
이상적으로는 이 시간을 5분에서 10분 미만으로 유지하는 것이 좋습니다. 또한 풍부한 리그를 통과하는 유체의 온도는 섭씨 37도로 유지되어야 합니다. 너무 뜨겁거나 너무 차가우면 조직이 파괴될 수 있다.
심장에서 혈액이 씻겨 나오면 소화 사용으로 전환하십시오. 완충액 b는 심장이 모양을 잃기 시작하고 둥글게 보이기 시작할 때까지 2-3분 동안 심장을 관류시킵니다. 관류가 진행됨에 따라 심근이 더 밝게 보여야 하며, 이제 심실을 잘라내고 더 작은 조각으로 다집니다.
심실 조직을 15ml의 따뜻한 수집 완충액이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 완충액의 조직을 플라스틱 피펫으로 부드럽게 혼합하여 단일 세포 심근세포 혼합물을 만듭니다. 1분 후 혼합물을 새 튜브로 옮기고 펠릿이 형성된 후 침전시킵니다.
슈퍼 네임드를 버리고 소생합니다. 펠릿화된 세포를 5ml의 중화 세척 버퍼에 현탁시킵니다. 이제 단일 세포 분석을 위해 세포를 선택할 준비가 되었습니다.
세포를 작은 페트리 접시에 희석하여 개별적으로 선택할 수 있도록 합니다. 현미경으로 에어록에 부착된 당겨진 피펫을 사용하여 건강한 개별 세포를 선택합니다. 세포를 채집할 때 오염을 피하고 포집량을 2마이크로리터 미만으로 최소화
해야 합니다.개별 세포를 개별 PCR 튜브의 바닥에 놓고 드라이아이스에 즉시 동결합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 영하 80도에서 100 마이크로몰 및 1개의 XDNA 현탁액 완충액에서 관심 유전자에 대한 모든 프라이머 쌍을 재현탁하기 시작하고 프라이머 쌍을 20 마이크로몰로 결합 및 희석합니다. 마지막으로, 모든 프라이머 쌍을 최종 농도가 200나노 어금니인 하나의 용액으로 희석합니다.
프라이머 용액이 준비되면 마스터 믹스를 즉시 조립하고 냉동실에서 냉동 세포를 제거한 다음 30초 동안 최대 힘으로 원심분리합니다. 그런 다음 각 튜브에 9마이크로리터의 마스터 믹스를 추가하고 PCR을 진행합니다. PCR 기계에서 튜브를 제거하고 각 반응에 4마이크로리터의 엑소를 추가합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 각 반응을 실행한 다음 섭씨 80도에서 15분 동안 실행합니다. 섭씨 4도에서 유지하여 마무리합니다. 다음으로, DNA 현탁액으로 샘플을 1-5 호석합니다.
이제 샘플은 정량적 PCR 분석을 위한 준비가 되었습니다. 우리는 이제 48 point 48 또는 96 point 96 유전자 발현 어레이를 사용하여 이 재료 및 유체 IMS BIOMARK 시스템을 사용합니다. 96 well 및 3 84와 같은 보다 전통적인 QPCR 형식을 사용할 수 있습니다.
그러나 Well Format은 단일 세포에서 수행할 수 있는 분석 수를 제한합니다. 이 공정은 펠릿과 단일 세포 모두에서 이중 가닥 CDNA를 증폭할 수 있는 Sigma의 WTA two 키트를 사용합니다. 이 키트는 먼저 단일 세포의 막을 파괴한 다음 두 차례에 걸쳐 메시지를 증폭합니다.
라이브러리 준비 단계를 수행한 후 라이브러리 샘플의 1/5을 WTA 2 증폭 마스터 믹스 70마이크로리터에 추가하고 키트 매개변수를 사용하여 샘플을 25주기 동안 증폭합니다. 다음으로, 카약 퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 샘플을 정제하고 Cain의 카약 큐브에서 처리합니다. 완료되면 고속 진공을 사용하여 정제된 샘플을 5마이크로리터로 농축하고 WTA two 키트를 사용하여 이전 증폭과 동일한 매개변수를 사용하여 샘플을 17번의 추가 증폭 주기를 거칩니다.
이전과 같이 시료를 정제하고 NanoDrop 분광광도계와 애질런트의 생물분석기 DNA 7, 500 키트를 사용하여 시료의 품질을 확인합니다. 이제 Nimble Gen의 단색 라벨링 키트를 사용하여 각 증폭된 세포 샘플에서 2마이크로그램의 이중 가닥 CD NA를 라벨링하고, 5마이크로그램의 CY 3 라벨링 샘플을 NimbleGen 유전자 발현 어레이에 하이브리드화한 후 슬라이드를 세척 및 건조하여 이미징할 수 있도록 합니다. 분자 장치의 유전자를 사용하여 100 POW 및 300에서 350 PMT로 보정 된 설정의 스캐너 4, 200을 선택합니다.
유전자 칩을 분석한 다음 민첩한 유전자의 민첩한 스캔 소프트웨어를 사용하여 각 어레이에 대한 쌍 파일을 생성하고 데이터 분석을 진행합니다. 성공적으로 번식한 심장은 전형적인 직사각형 형태를 유지하는 건강한 심장 세포의 높은 비율을 산출했습니다. 만약 그 풍부함이 잘 작용하지 않았다면, 많은 세포들이 죽었을 것이다.
WTA 2가지 방법으로 세포를 증폭하고 최종 제품의 품질을 테스트했습니다. 이 샘플은 nano drop spec spectometer 판독값과 bioanalyzer 칩의 electropherogram 판독값 모두에서 강력한 증폭을 보여주었습니다. 요약하면, 많은 유전자가 심근세포에서 강력하게 발현되었습니다.
그러나 모든 분석이 QPCR 데이터에서 나노 유체의 하위 집합에서 나온 피크 용융 온도의 이 히트 맵에서 볼 수 있듯이 동일하게 신뢰할 수 있는 것은 아닙니다. 이 맵의 각 행은 43개의 개별 QPCR 분석에서 하나의 단일 세포 샘플을 나타냅니다. 일부 분석은 매우 가변적이며 PCR 특이성이 더 높은 분석보다 신뢰성이 떨어질 수 있습니다.
이 절차를 완료할 때 미리 고품질 셀을 확보해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 다운스트림 유전자 발현 프로파일링의 품질이 보장됩니다. 일단 마스터하면 단일 세포 분리 절차를 2시간 30분 이내에 완료할 수 있으며, 이러한 세포의 유전자 발현 프로파일링은 2일 이내에 완료할 수 있습니다.
이 기사는 생존 성인 마우스 심근세포의 분리 및 단일 세포 수준에서의 유전자 발현 분석에 대해 설명합니다. 양적 PCR 및 마이크로어레이 분석을 위한 용해액 준비 방법을 강조하며, 단일 세포 프로파일링의 장점을 강조합니다.
Single-cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes enables biopharma researchers to resolve intrinsic cellular heterogeneity masked in bulk tissue analyses. This approach supports target validation by revealing expression variance and rare-cell phenotypes critical for mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. The method provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in early discovery workflows.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification in cardiovascular biology.