Name: RNAi - 중재 유전자 최저 및 VIVO에서 이뇨 분석 Aedes aegypti 모기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 RNAi 매개 유전자 최저와 생체 이뇨 분석을 결합한 Aedes aegypti 모기 연구 방법입니다. 이 기술은 수채널 기능과 체액 배출 메커니즘을 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는이 프로토콜의 그녀 비판적 의견 빅토리아 카펜터 감사드립니다.

부 전 - 성인 Aedes aegypti 모기에 RNAi - 중재 유전자 최저. 실험 개요는 그림 1을 참조하십시오. 1. dsRNA 합성 <ol><li> 관심과 제어 dsRNAs의 유전자에 대한 구체적인 dsRNAs을 합성. 주 : 우리는 3 '특정 cDNA 2 월말과 5 부착된 T7 뇌관 시퀀스로'에서 끝 (5'-TAA 전술 GAC TCA CTA 위치한 300-500 기본 쌍의 범위에서 PCR 단편을 위해 개발 primers를 추천 TAG GG-3 '). 파편의 특이 사항은 BLASTN 분석 3 확인하여야한다. </li><li> dsRNA를 합성하기위한 전사 반응을 T7 RNA 중합 효소를 활용 Ambion Megascript T7 높은 항복 전사 키트 (Ambion, 시약 표)를 사용합니다. 참고 : 유사한 시약 및 키트 다른 곳에서 사용할 수 있습니다. </li><li> dsRNA를 정화하려면 Megascript 키트와 지침에 따라 염화 리튬으로 침전. </li><li> purificat 후이온, 멸균 물 속에서 dsRNA 펠릿를 해산. microinjection에 대한 적절한 점도를 보장하기 위해 dsRNA 농도 2 μg / μl를 초과해서는 안됩니다. </li></ol> 2. 사출 준비 <ol><li> 간단한 마이크로 주입기는 튜브, 가위, 금속 바늘, 1 ML의 주사기, 그리고 한 ML 플라스틱 피펫 팁을 (그림 2 참조)을 사용하여 건설 수 있습니다. 튜브는 길이 ~ 40cm로 절단한다. 또한, 자동화된 마이크로 주입기는 그러한 Drummond Nanojet II 4로 사용될 수 있습니다. <ol><li> 이 ML 눈금 표시에서 주사기의 팁 (바늘 허브)를 잘라 플런저에서 고무 플런저 헤드를 제거합니다. </li><li> 고무 플런저 머리와 장소 다시 바늘 허브의 고무 플런저 머리에 금속 바늘을 사용하여 펀치 구멍. </li><li> 튜브의 한쪽 끝을에 바늘 허브를 놓고 마우스 피스 (또는 10 ML 싸이로 사용됩니다 다른 쪽 끝을에서 1 ML 플라스틱 피펫 팁을 배치ringe)는 주사에 필요한 공기 압력을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 고무 플런저 머리에있는 구멍에 유리 모세관 바늘을 놓고 너비는 액체를 통해 흐를만큼 큰 수 있도록 바늘의 팁을 끊다. 참고 : 바늘 끝의 최적 크기는 경험적으로 결정되어야한다 - 바늘 너비가 너무 작은 경우 바늘의 너비 이것이 외상과 높은 모기 사망률집니다 너무 큰 경우, 그것은 침투하기가 불가능합니다 모기 외골격. </li><li> 준비된 dsRNA 샘플에서 잠수함 주입 바늘과 마우스 피스 (또는 주사기)로 액체를 빨아하여 주사 바늘로 액체 샘플을 그립니다. 참고 :이 단계는 (아래) 생체내의 이뇨 분석 프로토콜에서 사용되는 PBS 버퍼를 비롯하여 모기에 주입되는 모든 액체 시약에 대해 동일합니다. </li></ol> 3. 모기를 수집하고 마취 <ol><li> Collec수거 유리병에 배터리 구동 흡인기로 하지마 모기. 수거 유리병 이상의 모자를 놓고 모기를 마취하기 위해 깨끗한 CO 2 패드에 병을 놓습니다. 참고 : 또한 모기가 얼음위에 anesthetized 될 수 있습니다. </li></ol> 4. 모기 분사 <ol><li> 수거 유리병을 열고 직접 CO 2 패드에 모기를 넣고 모기가 anesthetized 때까지 기다립니다. </li><li> 모든 남성 폐기하십시오. </li><li> 주사를 더욱 쉽게 액세스할 수 있도록 측면에 모기를 줄입니다. </li><li> 부상을 피하기 위해 다리 또는 날개에 의한 모기를 잡아. 당신은 또한 훌륭한 화필이나 모기를 조작하기 위해 깃털을 사용할 수 있습니다. </li><li> 첫 모기를 주입하기 위해 준비가되면 부드럽게 포셉와 흉부의 한쪽을 지원하며 흉부 반대편 (그림 2)로 바늘의 끝부분을 삽입합니다. 그것은 표피의 얇은 부분에 주입하고 바늘을 밀어 피하는 것이 좋습니다흉부에 깊이를 O. </li><li> 바늘이 곳에되면 모기에 액체를 폭파. 원하는 금액은 바늘의 액체 초승달 모양을 모니터에 따라 결정됩니다. 특정 볼륨에 필요한 mm의 갯수는 유리 모세관 바늘 (πr 2 시인데)의 실린더 부피를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 일반적으로 주사에 사용되는 dsRNA의 효과적인 금액은 1 μg이다. </li><li> 액체는 모기에 주입되면 바늘을 조심스럽게를 철회. 흉부의 외부에 대형 액체 비말 형태 않으면 모기는 폐기되어야합니다. 그리곤, 다음날 모기와 함께이 과정을 반복합니다. </li></ol> 5. 모기 복구 및 저장 <ol><li> 주입 후 저장 용기에 모기를 놓습니다. 예를 들어, 한 파인트 왁스는 메쉬가 마분지 뚜껑으로 안전 커버와 골판지 컵 (수프 컵) 정렬했습니다. 뚜껑이 노출되는 덮고 메쉬에 맞을 부분이 있습니다. 일단 모든 MOsquitoes가 컨테이너에 배치되며, 인큐베이션위한 환경 제어 챔버에 컨테이너를 놓고 같은 메쉬 커버의 상단에 배치 20 % 자당 젖었 면화 공 같은 음식 소스와 모기를 제공하고 있습니다. 생체내의 이뇨 분석에를 수행하기 전에, 각 모기의 수화 상태를 표준화하기 위해 12 시간 동안 물 소스의 dsRNA-주입 모기를 빼앗다. </li><li> dsRNA - 중재 유전자 최저의 효율이 변수가 될 수 있습니다. 유전자 입을은 주입 후 1 하루를 시작할 수 있으며 주사 후 4 육일까지 지속될 수 있습니다. 최대 유전자 최저를 달성하기위한 최적의 시간은 사용하는 모든 유전자에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 우리가 진행하기 전에 일반적으로, 우리는 dsRNA 주입 후 삼일 정도 기다리십시오. </li></ol> 파트 II - 생체내의 이뇨 분석에서는 Aedes aegypti 모기 성인에서 참고 :이 프로토콜은 작성자에 의해 개발되었으며황열병의 모기의 aquaporin 단백질의 RNAi - 중재 최저 사용은 aegypti 1 Aedes. 개별 모기 사이의 다양성을 방지하려면 모기는 그룹에서 분석되어야한다. 기술적인 이유로 치료를 당 5 모기 그룹을 권장합니다 - 모기가 주사 후에 소변 나물을 시작하기 전에 첫 번째 체중 측정을 수행하는 시간을 제한 금액이 있습니다. 6. 모기를 수집하고 마취 <ol><li> 모기를 수집하기 전에 분석 정밀 밸런스를 사용하는 모자와 빈 컬렉션 유리병의 무게를 기록합니다. 이 유리병은 모든 후속 측정에 사용됩니다. </li><li> 흡인기로 무게 수집 유리병에 5 암컷 모기를 수집합니다. 수거 유리병 위에 뚜껑을 놓고하고 모기를 마취하는 데 몇 초 동안 CO 2 패드에 앉자. </li></ol> 7. 초기 무게 측정 <ol><li> T를 타고정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기 그는 초기 체중 측정. </li><li> 모기의 무게와 뚜껑으로 수집 병을 복용하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 빼는 방법으로 다섯 모기 그룹의 무게를 계산합니다. </li><li> 수거 유리병을 열고 모기의 무게를 기록 후 직접 CO 2 패드에 모기를 놓습니다. 모기가 무게를 측정하는 동안 깨어하기 시작한다면, 그것을 열고 패드에 모기를 삽입하기 전에 몇 초 동안 CO 2 패드에 유리병을 설정합니다. </li></ol> 8. 사출 준비 <ol><li> RNAi - 중재 유전자 최저 프로토콜에 주어진 지시에 따라 마이크로 주입기를 설정합니다. </li><li> 마이크로 분사기의 유리 모세관 바늘을 놓고 바늘의 팁을 끊다 때문에 너비가 liq 충분히 크다을 통해 흐를하는 UID. </li><li> 잠수함 PBS 버퍼에 바늘과 주사 바늘로 버퍼를 그려,이 프로토콜에 사용할 원하는 금액은 각 모기에 대한 PBS의 1.25 μl입니다. 참고 :이 금액은 여성 모기 오에 의해 함락되는 혈장의 평균 금액을 모방한 것이었 지요. </li></ol> 9. 모기 분사 <ol><li> 마이크로 주입기로 쉽게 접근할 수 있도록 모기를 줄입니다. </li><li> 바늘이 곳에되면 모기에 PBS 버퍼를 날려요. </li><li> 액체는 모기에 주입되면, 비말은 흉부의 외부에 형성하고 있습니다. 이러한 비말은 신중하게 다음 단계 전에 제거되어야한다. </li><li> 다음은 모기와 함께 사출 과정을 반복합니다. 경험을 바탕으로 모기 생존율은 주사 후 거의 100 %가 될 것입니다. </li></ol> 10. 무게 모기 <ol><li> 주사 후에는 부드럽게 수집 유리병에 모기 배치그리고 모자. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기의 첫 번째 체중 측정을 가져가라. </li><li> 뚜껑과 모기와 수집 유리병의 무게를 복용하여 5 모기 그룹의 무게를 계산하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 뺍니다. 참고 : 모기가 CO 2 마취 패드에서 제거 후 2 분 이내에 소변을 만들어내는 시작할 것이다, 그래서 그들이 나물을 시작하기 전에 체중 측정을하는 것이 중요합니다. </li><li> 그들은 소변을 만들어내는 시작됩니다 작은 용기에 모기를 놓습니다. </li></ol> 11. 두 번째 이후 무게 측정 참고 : 모기의 무게 측정이 30 분 간격으로 복용해야하지만, 이것은 배설 속도에 따라 짧은 이상 간격을 조정할 수 있습니다. <ol><li> 30 분 후에, grou를 수집뚜껑과 같은 컬렉션 유리병에 흡인기 5 모기 P. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 모기의 다음 체중 측정을 가져가라. </li><li> 측정 후, 다음 30 분 동안 동일한 지주 용기에 모기를 놓습니다. </li><li> 시간을 원하는 금액에 대해이 과정을 반복합니다. </li></ol> 12. 결정 모기 배설 속도 <ol><li> 5 모기의 그룹으로 주입되었다 액체의 총 금액이 즉시 주사 후 체중에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다. </li><li> 특정 시점에서 모기의 그룹에 의해 배설되었다 소변의 양은 특정 시점에서 모기의 무게에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다. </li><li> 특정 시점에서 배설 율은 divi하여 계산할 수액체 주입 (표 1)의 총 금액하여이 시점에서 배설 소변 딩 금액입니다. </li></ol> 13. 대표 결과 유전자 최저 RNAi - 중재 및 생체내의 이뇨 분석에서이 Aedes aegypti 모기 이뇨의 aquaporins의 효과를 연구하기 위해 한센 실험실에서 사용되었습니다. Aedes aegypti Malpighian tubules로 표현되는 세 aquaporins는 모기 1 제어할 비해 배설 속도에 상당한 효과를 무너 뜨 렸어되었다. 그림 4는 이뇨 분석은 Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus 사이에 배설 률을 비교하는 데 사용되었습니다 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다 서로 다른 온도에서. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 1 그림. 10 모기 EA의 RNAi / 이뇨 분석의 흐름도 5. 그룹채널은 특정 유전자에 대한 dsRNA을 주사하고 십 모기 오천 그룹은 통제 dsRNA로 주입된다. PBS 200 μm의 HgCl 2 주입 모기의 또 다른 그룹은 긍정적인 컨트롤로 사용됩니다. 이 모기는 주입하기 전에, 3 시간 삼십분 간격의 주입 후에 무게가있다. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. RNAi - 중재 유전자 최저 및 생체내의 이뇨 분석의 간단한 미세 주입 장치. A. 유리 모세관 바늘은 주사에 사용. 회색 삼각형은 모기에 액체 주입의 양을 표시하는 바늘에 그려진 mm 단위로 나타냅니다. B. 한 ML의 주사기는 마이크로 주입기을 만드는 데 사용. 흰색 삼각형 바늘 허브를 대표하고 검정색 삼각형은 주사기의 플런저에 연결된 고무 플런저 머리를 나타냅니다. C. 관은에 마우스 피스를 장착하는 데 사용주입기. microinjection 장치의 마우스 피스로 사용됩니다 D. 한 ML 일회용 피펫 팁 (파란색 팁). E. AD 부품을 통합 microinjection 장치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 최적 모기 주입 사이트. A. 여성 Aedes aegypti 모기는 흉부에 큰 비늘 사이에 유리 모세관 바늘로 주입. 검은 막대는 크기 비교를위한 1mm를 나타냅니다. 암컷 모기 흉부의 그림 B.와 흰 반점은 모기 외골격의 하얀 비늘을 나타냅니다. 주사 바늘은 피어스 반점 사이에 모기가 주사하는 동안 사망률을 최소화해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 4 그림. 온도의 영향Culex quinquefasciatus 및 Aedes aegypti의 이뇨에 진짜야가. 이뇨 분석은 서로 다른 온도에서, 모기, Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus의 두 종족으로 수행되었다. 주사 후 첫 시간 동안 배설 율은 퍼센트에 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 그룹 </td><td> 타라 (G) </td><td> 주입하지 (G) </td><td> 주입 후 (G) </td><td> 1 시간 게시물 주입 (G) </td><td> 평균 중량 (MG) </td><td> 양을 주입 (μl) </td><td> 금액 배설 (μl) </td><td> % 배설 </td></tr><tr><td> 일 </td><td> 7.5938 </td><td> 7.6057 </td><td> 7.6104 </td><td> 7.6096 </td><td> 2.38 </td><td> 0.94 </td><td> 0.16 </td><td> 17.0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7.8252 </td><td> 7.8349 </td><td> 7.8415 </td><td> 7.8403 </td><td> 1.94 </td><td> 1.32 </td><td> 0.24 </td><td> 18.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.8896 </td><td> 7.9026 </td><td> 7.9077 </td><td> 7.906 </td><td> 2.6 </td><td> 1.02 </td><td> 0.34 </td><td> 33.3 </td></tr></tbody></table> 생체내의 이뇨 분석 결과 표 1. Aedes aegypti 4.에서 Aedes aegypti 모기 암컷으로 수행한 생체내의 이뇨 분석에서 ° C.의 원시 데이터

<ol><li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578(2010).</li>
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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

사용되는 RNAi 프로토콜은 캘리 포니 아주 리버 사이드 6,7 대학에서 알렉산더 Raikhel의 연구실에서 개발 Garver 및 Dimopoulos 사에 의해 출판 프로토콜과 비슷했습니다. 이 비디오 프로토콜에 표시된 실험적 접근 방법은 생체내 환경에의 곤충 이뇨에 관련된 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 곤충, Malpighian의 tubules의 배설 기관은 이뇨를위한 &#39;단순&#39;모델 시스템으로 연구자 세대의 관심을 받고있다. 이 오르간은 Drosophila의 통관 8 일 현재 RNAi와 같은 역방향 유전 방식과 다른 곤충 종의에서 공부하실 수 있습니다 Malpighian 가느다란 관 생리학 9,10에 관련된 많은 유전자를 발견했다 xenobiotics에 관한 일을하고있다. 많은 동종 유전자는 쉽게 다양한 곤충 종 11 게시된 게놈 시퀀스에서 확인할 수 있습니다. 세 일 이...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 고수익 키트 </td><td> Ambion 주식 회사 </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 버퍼 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 튜브 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 한 ML 플라스틱 피펫 팁 </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> 블루 팁 </td></tr><tr><td> 한 ML의 주사기 </td><td> Becton, 디킨스와 회사 </td><td> 309,602 </td><td></td></tr><tr><td> 가위 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 금속 바늘 </td><td> 캐롤라이나 체액 </td><td> 654,307 </TD&gt; <td> 크기 5 </td></tr><tr><td> 패드 들아 </td><td> Genesee 과학 </td><td> 789,060 </td><td></td></tr><tr><td> 배터리 구동 흡인기 W / 컬렉션 유리병 </td><td> UPMA 실험실 </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> 파인 팁 포셉 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,095 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 모세관 바늘 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> 스테레오 해부 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> 분석 정밀도의 균형 </td><td> Mettler 톨레도 </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 84,097 </td><td></td></tr><tr><td> 1 파인트들이 줄지어 종이 컵 닦았단 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td> 제조 수프 컵 </td></tr><tr><td> 메쉬 네트 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td> 플라스틱 플라이 거즈 </td></tr></tbody></table>

rnai - 중재 유전자 최저 및<em&gt; vivo에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; aedes aegypti</em&gt; 모기

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

이 비디오 프로토콜은 곤충에서 특정 유전자를 분해하고 배설 률을 측정하는 소설 bioassay를 수행하기위한 효과적인 기법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충의 이뇨 과정의 이해를 얻는 데 사용하며 단일 혈액 식사에서 액체의 엄청난 양의 걸릴 수있는 혈액 먹이를 arthropods의 이뇨의 연구에 특히 유용합니다. 생체내의 이뇨 분석에서와 결합된 이러한 RNAi - 중재 유전자 최저는 Aedes aegypti 모기 이뇨 1 aquaporin 유전자의 RNAi-매개 최저의 효과를 연구하기 위해 한센병 연구소에 의해 개발되었다. 프로토콜은 두 부분의 설정은 다음과 같습니다 첫 번째 데모는 간단한 모기 분사 장치를 구성하는 방법과 RNAi - 중재 유전자 최저에 대한 모기의 흉부에 dsRNA를 준비하고 주입하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 데모를 결정하는 방법을 보여줍니다생체내의 bioassay에를 사용하여 모기의 배설 속도.

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를 결합<em&gt; 생체내에서</em관심있는 유전자의 효과 최저를 공부하기&gt; 이뇨 분석은 모기 유체 배설에 있습니다.

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

이 비디오 프로토콜은 곤충의 특정 유전자를 넉다운(knockdown)시키고, 배설량을 측정하기 위한 새로운 생물학적 분석법(bioassay)을 수행하는 효과적인 기술을 보여줍니다...

본 비디오 프로토콜은 곤충의 특정 유전자를 넉다운(knock down)하고 배설률을 측정하기 위한 새로운 바이오어세이를 수행하는 효과적인 기술을 보여줍니다. 오늘 시연할 기술은 RNAi 매개 유전자 넉다운과 인 비보(in vivo) 이뇨 어세이를 결합한 것입니다. 이 방법은 다양한 곤충 종의 이뇨 작용을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 실제로 저희는 두 가지 서로 다른 모기 종에서 아쿠아포린(aquaporin) 물 통로의 기능을 연구하기 위해 이 방법을 개발했습니다.오늘 시연할 프로토콜은 두 부분으로 구성되어 있습니다. 첫 번째 시연에서는 간단한 모기 주입 장치를 제작하는 방법과 RNA 매개 유전자 넉다운을 위해 이중 가닥 RNA를 준비하여 모기의 흉부에 주입하는 방법을 설명합니다. 두 번째 시연에서는 in vivo 바이오어세이를 사용하여 모기의 배설률을 측정하는 방법을 설명합니다. RNAi 매개 유전자 넉다운을 수행하기 위한 첫 번째 단계로, 표적 유전자에 대한 특정 이중 가닥 RNA와 대조군 이중 가닥 RNA를 합성합니다. 추가로 필요한 장비 및 재료에는 모기 포집을 위한 포집 병이 포함된 흡입기가 있습니다.미세 팁 핀셋, CO2 가스 실린더에 연결된 CO2 플라이 패드, 플라이 패드 세척용 에탄올, 광원이 포함된 실체 현미경, 필요시 사용할 니들 풀러. 1mm 간격으로 표시된 유리 모세관 바늘, 모기 주입을 위한 마이크로 인젝터, 주입 후 모기를 넣을 용기, 그리고 주입 후 모기에게 제공할 20% sucrose, 적신 솜 뭉치 또는 물에 적신 건포도와 같은 먹이원. 간단한 마이크로 인젝터는 가위를 사용하여 제작할 수 있습니다.금속 바늘, 유리 모세관, 1 mL 주사기, 1 mL 플라스틱 피펫 팁 및 약 40 cm 길이로 자른 튜브를 준비합니다. 주사기 바늘 허브의 끝부분을 0.2 mL 눈금 표시에서 자르고 고무 플런저 헤드를 제거합니다. 금속 바늘을 사용하여 플런저 헤드에 구멍을 뚫습니다.유리 모세관을 구멍에 넣고 헤드를 다시 시린지에 장착합니다. 그런 다음 시린지 팁을 튜브의 한쪽 끝에 끼우고, 반대쪽 끝에는 1 mL 플라스틱 피펫 팁을 장착합니다. 이것이 마우스피스로 사용됩니다.또는 10 milliliter 주사기를 사용하여 주입에 필요한 공기압을 생성할 수 있습니다. 다음으로 유리 모세관 바늘을 고무 플런저 헤드 구멍에 끼우고, 액체가 흐를 수 있을 만큼 너비가 충분하도록 바늘 끝을 부러뜨립니다. 주입 바늘을 준비된 D-S-R-N-A 샘플에 담근 후, 마우스피스나 주사기로 액체를 빨아들여 주입 바늘 안으로 액체 샘플을 채웁니다.배터리 구동식 흡입기로 모기를 포집하여 수집 바이알에 담습니다. 바이알에 캡을 씌운 후 깨끗한 CO2 패드 위에 올려 모기를 마취시킵니다. 또는 얼음 위에서 모기를 마취시킬 수도 있습니다.주입 과정을 시작하기 전에 모든 수컷을 제거하십시오. CO2 패드 위에서 깃털이나 붓을 사용하여 수컷을 이동시킬 수 있습니다. 부상을 방지하기 위해 핀셋으로 모기의 다리나 날개를 잡으십시오.첫 번째 모기에 주입할 준비가 되면, 포셉으로 흉부의 한쪽 면을 부드럽게 지지하고 바늘 끝을 흉부의 반대편에 삽입합니다. 큐티클의 얇은 부분에 주입하고 바늘이 흉부 너무 깊숙이 들어가지 않도록 주의하는 것이 좋습니다. 바늘이 적절히 위치하면, 액체를 모기 내부로 불어 넣습니다.이중 가닥 RNA는 혈림프 내로 확산되어 세포에 흡수되며, 이는 표적 유전자의 RNAi 매개 넉다운을 유발합니다. 주입 후, 모기는 보관용 용기에 넣습니다.예를 들어, 판지 뚜껑으로 고정된 메쉬 덮개가 있는 1파인트 왁스 라인 판지 컵을 사용할 수 있습니다. 모든 모기를 용기에 넣은 후, 용기를 환경 제어 챔버에 넣어 배양해야 하며, 세대를 유지하기 위해 메쉬 덮개 위에 20% sucrose, 비누, 솜 뭉치와 같은 먹이를 제공해야 합니다. 최근 곤충의 이뇨 작용은 연구자들에게 단순한 모델 시스템으로 주목받고 있습니다.RNAi와 같은 기술은 분자 수준에서 이뇨 작용을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 영상에서 시연하는 기술은 생체 내(in vivo)에서 이뇨 작용을 연구하는 간단한 방법을 제공할 것입니다. 암컷 모기는 PBS 버퍼를 주입한 후 2분 이내에 소변을 배출하기 시작하므로, 배출이 시작되기 전에 체중을 측정하는 것이 중요합니다.본 프로토콜의 두 번째 부분에서는 Jedi 모기를 이용한 in vivo 이뇨 작용 분석법 수행 방법을 시연하겠습니다. 녹다운 프로토콜에서는 필요하지 않았으나 본 프로토콜에서 필요한 추가 재료 및 장비는 RPBS 완충 용액과 무게 측정을 위한 분석 정밀 저울이며, 저울은 0.1mg의 정밀도를 갖추어야 합니다. 모기를 수집하기 전에 분석 정밀 저울을 사용하여 캡이 달린 빈 수집 바이알의 무게를 기록하십시오. 이 바이알은 이후의 모든 측정에 사용됩니다.모기가 들어있는 바이알의 캡을 닫은 채로 정밀 저울에 올려 암컷 5마리의 초기 무게를 측정합니다. 암컷 모기 5마리를 마취시킨 후, 마이크로 인젝터로 더 쉽게 접근할 수 있도록 CO2 패드 위에 일렬로 배치합니다. 바늘을 흉부에 삽입한 다음, 모기 내부로 PBS 버퍼를 주입합니다.주입 후, 모기를 수집 바이알에 조심스럽게 넣고 캡을 닫습니다. 캡이 닫힌 상태의 현장 수집 바이알을 정밀 저울에 올려 주입된 모기 5마리의 첫 번째 무게를 측정합니다. 모기 5마리 집단의 무게는 캡이 닫힌 현장 수집 바이알의 무게에서 캡이 닫힌 빈 수집 바이알의 무게를 빼서 계산할 수 있습니다.모기 측정은 30분 간격으로 수행해야 하지만, 배설 속도에 따라 간격을 더 짧게 또는 길게 조정할 수 있습니다. 30분 후, 흡입기(aspirator)를 사용하여 모기 5마리 그룹을 뚜껑이 있는 동일한 수집 바이알에 수집하십시오. 그런 다음 뚜껑이 있는 현장 수집 바이알을 정밀 저울 위에 올려 다음 무게 측정을 수행하십시오.이뇨 작용 분석은 두 종의 모기인 ADA aegypti와 kyx kti를 사용하여 서로 다른 온도에서 수행되었습니다. 주입 후 첫 1시간 동안의 배설률은 백분율로 표시되었습니다. 그래프는 온도가 상승함에 따라 이뇨 작용이 크게 증가함을 보여줍니다.또한 두 모기 종 간의 배설률 차이를 관찰했습니다. 본 연구에서 제시한 in vivo 이뇨 분석법은 향후 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. RNAI와 같은 역유전학 방법 외에도, 신호 전달 억제제 등의 약물이 곤충의 이뇨 작용에 미치는 영향을 연구하는 데 활용될 수 있습니다.또한 이는 대상 인스턴스에서 제노바이오틱(xenobiotic) 제거 과정을 연구하는 강력한 분석법입니다.

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생물학

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 뎅그열 바이러스를 항구 여성 A. aegypti 모기로 dsRNA를 주입하기 위해 제임스 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , 주사 바늘을 보정 사출 설정을 조작하고, 흉부에 dsRNA를 주입에 대한 기술은 그림이다.

여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 말라리아 기생충을 항구 아노 펠 레스 모기 gambiae로 dsRNA를 주입하기 위해 Dimo​​poulos 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. 사출 설정을 조작하고 흉부에 dsRNA를 주입 기술은 그림이다.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

RNA-Seq 분석은 비모델 유기체에서 적응 형질의 분자 토대를 식별하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에서는 모기 사육에서 RNA 염기서열 분석 및 RNA-Seq 데이터의 생물정보학 분석에 이르기까지 diapause와 non-diapause Aedes albopictus 모기 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

우리는 청색 꼬리 댐을 사용하여 주문 오도나타 (잠자리와 담석)의 곤충에 전기 포기 매개 RNA 간섭에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(이쉬누라 세네갈렌시스: 코나그리니대 : 지고피테라) 및 파이드 스키머 드래곤 플라이(Pseudothems zonata:...

오도나타에서 전기 기화 매개 RNA 간섭 방법

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

배우세요 RNAi 매개 유전자 최저와 생체 이뇨 분석을 결합한 Aedes aegypti 모기 연구 방법입니다. 이 기술은 수채널 기능과 체액 배출 메커니즘을 분석하는 데 활용됩니다.

RNAi - 중재 유전자 최저 및

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